全二维气相色谱-飞行时间质谱解析黄土高原产区赤霞珠葡萄酒挥发性组分特征挥发性化合物

田欣，祁新春，张泽，缪成鹏，徐岩，唐柯*

1(教育部工业生物技术重点实验室,江苏 无锡，214122) 2(食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122) 3(江南大学 生物工程学院，酿造微生物学与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122) 4(山西戎子酒庄有限公司，山西 临汾，041000)

葡萄酒是世界上最流行的酒精饮料之一，葡萄酒的香气反应了一款葡萄酒的品种、产地、酿造工艺等，其决定着葡萄酒的风味和典型性[1]，是葡萄酒品质评价中最重要的标准之一，也是消费者选择葡萄酒的重要因素之一，所以葡萄酒香气的研究对于提高葡萄酒的品质和产区典型性都具有重要意义。中国葡萄酒产业发展迅猛，涌现出很多优质的葡萄酒产区，其中黄土高原产区是我国近年来一个新兴的葡萄酒产区，该地区具备葡萄栽培独特的气候和地域特点，为酿酒葡萄的生长提供了得天独厚的风土条件[2]，受到国内外的广泛关注。目前对于该产区葡萄酒风味特征及挥发性化合物的研究已经逐渐开始展开[3-5]。

近年来国内对于不同产区不同品种的葡萄酒的香气研究已经非常广泛，但是对于葡萄酒挥发性成分的检测分析主要基于一维气相色谱技术。李佳等[6]通过GC-MS对昌黎地区的赤霞珠葡萄酒的香气成分进行了解析，共鉴定出36种香气物质，其中醇类占香气成分的一半以上，赋予葡萄酒产区特性，并且甲氧基异戊酸乙酯、3-甲氧基癸酸乙酯等化合物也可能为特征香气成分；宋慧丽等[7]通过顶空固相微萃取结合气相色谱技术(headspace solid-phase microextraction combined-compre-hensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)共检测出河西走廊赤霞珠原汁和酒中130种香气化合物；侯敏[8]运用了感官分析与仪器分析(GC-MS)相结合的手段明确了沙城产区赤霞珠葡萄酒香气特征描述词和83种关键香气化合物；王蓓等[9]采用搅拌棒吸附萃取-气相色谱/质谱联用技术(SBSE-GC-MS),对我国威代尔冰葡萄酒的挥发性成分进行检测分析，共定性出109种挥发性成分；左俊伟等[10]同样采用了HS-SPME-GC-MS对宁夏产区霞多丽和贵人香干白葡萄酒的香气物质进行检测，共定性得到49种香气物质，并明确了果香特征的主要贡献化合物。这些研究丰富了对我国葡萄酒风味化学的认识并对进一步的香气特征的探究奠定了基础。

但是葡萄酒中香气成分较多且复杂，通过一维气相色谱技术进行检测会出现化合物共流出的现象，影响了定性结果的准确性，而全二维气相色谱的出现较好的改善了该问题。这项技术发明于上世纪九十年代，其利用两根性质不同的色谱柱，将第一维气象色谱柱分离出的组分的流出到第二维气相色谱柱(两次分离的色谱柱性质不同)中进行再次分离，从而极大提高峰容量和分辨率，同时也提高灵敏度[11]。从而相对一维气相色谱技术，较好的改善了共流出的现象。目前国外已经将全二维色谱技术广泛用于葡萄酒香气的研究中，WELDEGERGIS等[12]采用全二维飞行时间质谱技术(GC×GC-TOFMS)对南非皮诺塔基葡萄酒的挥发性化合物进行了全面的检测，共定性得到206种化合物；WELKE等[13]采用GC×GC-TOFMS对巴西霞多丽葡萄酒进行了定性和定量分析；NICOLLI等[14]则通过感官分析、GC-O和GC×GC-TOFMS分析了不同葡萄园管理手段对葡萄酒香气的影响。

目前全二维气相色谱技术在我国已经应用于白酒[15]、茶[16]、调料[17]等食品的检测分析中，而在葡萄酒香气物质的研究中还鲜有报道，因此本研究采用GC×GC-TOFMS对黄土高原产区赤霞珠葡萄酒中挥发性成分进行鉴定，以期探讨全二维气相色谱技术在葡萄酒香气分析中的应用，同时也为深入探究黄土高原产区葡萄酒的风味特征提供基础数据与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5款赤霞珠干红葡萄酒分别来自黄土高原产区五个小产区(驮腰坡、大石头、十里铺、南头、东廒)，均由山西戎子酒庄提供；NaCl(分析纯)，上海国药集团；C5-C30 烷烃标样(色谱纯),天津光复精细化工研究所。具体信息见表1。

表1 赤霞珠干红葡萄酒样品信息Table 1 Cabernet Sauvignon dry red wine sample information

1.2 仪器与设备

全二维气相色谱-飞行时间质谱系统由Agilent 7890N气相色谱(美国Agilent公司)，KT-2001冷喷调制器(美国Zoex公司)和Pegasus 4D飞行时间质谱仪(美国Leco公司)组成；2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头，美国Supelco公司；MPS多功能自动进样器，德国Gerstel公司；DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司；Rxi-17Sil MS(1.1 m×0.25mm ID，0.25 μm)，美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)

取8 mL葡萄酒样品置于20 mL顶空样品瓶中，加入3 g氯化钠。萃取温度 50 ℃，样品平衡 5 min，萃取 45 min，转速为 250 r/min。萃取结束后进样，萃取头在GC进样口(250 ℃)解析附5 min。

1.3.2 全二维飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)仪器条件

气相色谱条件：色谱柱：一维色谱柱DB-FFAP，二维色谱柱Rxi-17Sil MS。色谱条件：进样口温度 250 ℃，以不分流模式进样。一维柱温箱升温程序：起始温度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min 的速率升温至 230 ℃并保持 15 min。调制器调制时间4 s，热调制时间为 1 s，调制补偿温度为 20 ℃。二维柱温箱升温程序：起始温度 40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。以高纯氦气(>99.999 5%)作为载气，恒流模式，流速：1 mL/min。

飞行时间质谱条件：采用EI离子源，离子源温度 230 ℃，传输线温度280 ℃，电压控制 70 eV。检测器采集质量数范围35～400 amu，采集频率 100 spectrum/s，电压控制1 430 V。

1.4 数据分析

数据由LECO公司Pegasus 4D工作站采集，通过仪器自带的ChormaTOF软件对数据进行分析，其中色谱峰的峰宽分别设为24 s和0.2 s，自动识别信噪比大于200的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库(mainlib，Wiley 9和replib)比对，进一步通过保留指数(保留指数根据C5-C30计算得出)定性，选择相似度及反相似度不小于700的化合物作为最终鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 黄土高原赤霞珠葡萄酒挥发性化合物分离特性解析

由于葡萄酒香气组成和基质十分复杂，采用一维气相色谱技术进行分离检测尚存在峰容量不足、共流出、灵敏性低等问题，从而影响最终定性的结果或无法鉴定出一些关键化合物，远远无法满足目前我们对于葡萄酒风味化学研究的需要。全二维气相色谱技术的出现，为更好的分离鉴定这些复杂的组分提供了有力的工具。全二维气相色谱具有分离能力强、峰容量大、选择性高的特点，与飞行时间质谱的连用更好的提高了其灵敏性，从而可以检测到更多痕量物质，丰富对风味化学研究的认识[11]。

由图1可见，一维色谱图中存在大量化合物共流出的现象，在同一个一维时间点上，存在多个物质。而进一步采用二维色谱分离，这些共流出的化合物在二维色谱上得到了较好的分离，二维色谱具有强大的分离能力，可以更好的进行复杂组分的分离鉴定。

图1 黄土高原产区赤霞珠葡萄酒1D总离子流色谱图(a)及2D总离子流色谱图(b)Fig.1 GC × GC-TOFMS total 1D (a) and 2D (b) ion chromatogram of volatile compounds of Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

在全二维色谱分离中，由于采用性质不同的两种色谱柱进行分离，其具有相同结构的化合物在谱图上分布具有规律性的特点，同系物呈现线性分布[15,18]，可以为葡萄酒中香气化合物的定性提供依据，从而提高鉴定结果的可靠性。在GC-O结合一维气相色谱对具有香气贡献的化合物进行鉴定的过程中，由于共流出及灵敏性等问题，使一些关键化合物不能被很好的鉴定出来,在结果中存在一些未知物质，前期席艳茹等[19]采用GC-O-MS对来自黄土高原产区的两个小产区的赤霞珠葡萄酒进行分离，但仍有一些重要的的香气贡献物质无法被定性，而在对镇江陈醋的研究中，研究人员将GC-O与全二维技术结合使用[20]，便可以较好的对关键化合物进行高效的鉴定。与前期对于该产区赤霞珠葡萄酒挥发物质的研究相比，蒋宝等[21]采用HS-SPME结合一维气相色谱技术(GC-MS)对黄土高原产区赤霞珠葡萄酒进行检测鉴定，共鉴定到45种香气化合物，而通过GC×GC-TOFMS进行分离鉴定一共可以鉴定到600种化合物，而在每个小产区的酒中也可以定性到400种左右化合物(见表2)，相对一维具有明显的优势，特别是具有较高的灵敏性，可以鉴定到一些痕量化合物，从而丰富我们对葡萄酒风味化学的认识，也为进一步探究产区特性提供基础。

表2 黄土高原赤霞珠葡萄酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定化合物统计Table 2 Volatile compounds identified in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

2.2 黄土高原赤霞珠葡萄酒挥发性化合物分析

通过全二维气相色谱与飞行时间质谱联用的方法，对黄土高原产区赤霞珠葡萄酒挥发性组分进行检测，通过Pegasus 4D工作站对质谱库的检索结合保留指数比对，共定性得到600个化合物，其中以酯类、芳香族、萜烯类和醇类为主，分别定性到128种、113种、85种和83种化合物。该结果同赤霞珠葡萄酒风味化合物的研究具有一致性[22-23]。

在黄土高原产区中，来自不同的小产区中定性到的化合物总数相差不大分别，其中来自大石头产区的赤霞珠葡萄酒定性到430种化合物、十里铺产区定性到407种，南头产区定性到392种，东廒产区定性到415种以及在驮腰坡产区定性到396种化合物。而对比不同小产区中类别的数量，与整体情况一致，都以酯类、芳香族、萜烯类和醇类为主且小产区间相差不大，该结果说明产区间具有较好的一致性，从而具有共有的产区特征性。

在鉴定的化合物中，酯类物质的数目最多，占整体数目的21.33%，酯类是葡萄酒中含量最多的一类物质，酯类化合物是一种良好的风味物质，大多呈现果香类的香气特征。如乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯以及苹果酸二乙酯等，其具有苹果、香蕉、椰子和桃李等水果香。此外，一些短链酯主要产生果香、花香等香气，是葡萄酒中清新果香的主要来源，而一些长链酯则产生类似坚果、蜂蜜和油脂的香气，为葡萄酒带来更为厚重的香气特征，增加葡萄酒风味的复杂性[24]。

芳香族化合物占18.83%，芳香族化合物主要来源于原料中芳香族氨基酸的分解代谢，为酒的风味带来一些花香、香料类的香气，从而增加葡萄酒香气的复杂性，如苯甲醇、苯乙醇为葡萄酒带来类似玫瑰的香气，而肉桂酸乙酯、香草醛等则为葡萄酒贡献了类似香料、烟熏的香气特征。

醇类化合物也是风味物质中重要的一类芳香物质，本研究共检测到83种，占总量的13.83%，其与酯类物质共同奠定了葡萄酒中的水果香气和清香的基调，其中顺-3-己烯醇、反-2-己烯醇等为葡萄酒贡献了青草类的清香。

醛酮类化合物共检测到74种，占总物质的12.33%，其中醛类物质为酒带来一些植物类和油脂的香气，如己醛、反-2-甲基-2-丁烯醛、壬醛等，而酮类则主要是一些奶香和坚果类的香气特征，如2,3-丁二酮等。

含硫化合物也是葡萄酒中关键的一类香气化合物，由于其阈值较低，且具有独特的香气特征，虽然目前认为其主要是一些不良气味的来源，但其对葡萄酒整体风味具有较大的影响，目前同样是葡萄酒风味研究的热点之一[25]。在黄土高原产区赤霞珠葡萄酒中共检测到25种含硫化合物，占总体数目的4.17%。其中2-甲基噻吩等物质具有肉类的香气特征[26]，3-甲硫基丙醇具有煮土豆的香气特征，是威代尔冰酒中的关键化合物[27]，这些含硫化合物均为葡萄酒增添了香气的复杂性。

此外，萜烯类化合物也是葡萄酒中重要的一类化合物，是葡萄酒品种香的重要来源[28]，具有清香的植物或水果和花香的香气，并且很多萜烯类物质具有重要的生理活性，一直是葡萄酒风味研究中的热点。在黄土高原产区赤霞珠葡萄酒样品中共定性到85种萜烯类化合物，占总体的14.17%(表3)。之前蒋宝[21]等人只在黄土高原产区新酿赤霞珠葡萄酒中检测到1种萜烯类化合物。而席艳茹等[29]人结合GC-O在2013年黄土高原5个小产区新酿赤霞珠葡萄酒中共定性到8种具有香气贡献的萜烯类化合物。相比一维的检测，通过GC×GC-TOFMS可以更加有效对痕量萜烯类化合物进行检测，并且可以很好的对同分异构体进行鉴定，如E-罗勒烯和Z-罗勒烯。萜烯类化合物主要为葡萄酒的风味贡献植物类和花香类的特征，如1,4-桉叶素和1,8-桉叶素是澳大利亚赤霞珠葡萄酒中典型的桉树香气的贡献化合物[30]，γ-萜品烯、α-雪松烯、1-萜品醇、4-萜品醇等主要呈现生青、松叶类的香气特征，异香叶醇、香茅醇、β-大马酮、α-紫罗兰酮等则为葡萄酒贡献玫瑰、紫罗兰等花香类的香气特征，这些为葡萄酒的风味带来清新清甜的植物香气和复杂性。

表3 黄土高原赤霞珠葡萄酒中萜烯类化合物Table 3 Terpenes in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

续表3

序号名称CAS1RT/s2RT/s保留指数a参考保留指数b相似性反相似性可能性14异松油烯586-62-910242.761283.41280918932167415顺式玫瑰氧化物876-17-511722.511357.31358862872264416(-)-玫瑰醚16409-43-111722.511357.31390859919359817反式玫瑰醚876-18-612002.611371.31365716885564818α-侧柏酮546-80-513162.3314311438798819160419α-环柠檬醛432-24-613482.41448.11430831837377520顺式-里那醇氧化物5989-33-313961.991473.41478908920375821顺式-对薄荷烷-3-酮491-07-613962.491473.71465753775303222反式-里那醇氧化物34995-77-213961.981473.41452912919376723橙花醇氧化物1786-08-914002.361475.71500878880920424茶香螺烷36431-72-814643.171510.41523882915886825(1S)-(-)-樟脑464-48-215002.41529.61532865881559926葡萄螺烷65416-59-315122.941536.415279089317429271-(1,4-二甲基-3-环己烯-1-基)乙酮43219-68-715202.321540.41504727775832528里那醇78-70-615281.81544.51552960960642329α-雪松烯469-61-415843.621575.91571812871237530(-)-异胡薄荷醇89-79-215882.011577.215757118092905311-萜品醇586-82-315881.941577.11582905907570532小茴香醇1632-73-116041.861585.815978778848673334-萜品醇562-74-316402.081605.71612943944777134脱氢芳樟醇29957-43-516481.731610.11613766855568535反式-依杜兰41678-29-916562.81615.216027498223829362-(4-甲基-3-环己烯基)丙醛29548-14-916802.191628.61620810823271937β-环柠檬醛432-25-716882.361633.21622919926866438β-萜品醇138-87-416881.881632.91641861877553439乙酸反式里那醇氧化物酯56752-50-217002.3616401619760797725940γ-松油醇21129-27-117041.9116421621964966197641反式罗勒烯醇7643-60-917201.7816511650776829275342罗勒烯醇5986-38-917201.7816511688732840234543藏红花醛116-26-717322.221658.11617903911854844乙酸香茅酯150-84-517402.421662.71662840872423645顺α-法呢烯28973-97-917442.911665.31657909926405046(E)-β-法呢烯18794-84-817482.891667.61662899918378847异龙脑醇124-76-517561.91671.51670736792286848(-)-龙脑醇464-45-918161.8617061675794842316249β-红没药烯495-61-418563.061731.11738905906422650水芹醛21391-98-018682.317381710838930725851环氧芳樟醇14049-11-718721.781740.11721731755736852反式吡喃里那醇氧化物39028-58-518721.781740.11724704794726153α-金合欢烯502-61-418882.851750.51745905925713154香茅醇106-22-919121.761764.51771921934441455α-姜黄烯644-30-419362.81779.81773895906853756γ-异香叶醇13066-51-819481.751786.418008909028984572-蒎烯-10-醇515-00-419681.791798.71767773812534258橙花醇106-25-219721.751801.11806891903394059异香叶醇5944-20-719921.751813.61820872875593660β-大马酮23726-93-420242.3618341830921922804061顺式-香苇醇1197-06-420321.771838.61866717757572762反式香芹醇1197-07-520361.781841.11836730791447563菖蒲烯483-77-2204031844.41840823855570364α,β-二氢-β-紫罗兰酮17283-81-720402.4618441854791829605865香叶醇106-24-120441.751846.11853916917339066香叶基丙酮3796-70-120682.341861.518628969066042

续表3

注：a，保留指数根据C5-C30正构烷烃计算得出；b，数据来源于NIST数据库。

研究还检测到呋喃、内酯、吡嗪等化合物，与上述物质共同组成了黄土高原产区赤霞珠葡萄酒的香气特征。

3 结论

本研究采用全二维气相色谱结合飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)技术对黄土高原5个小产区的赤霞珠葡萄酒中挥发性组分进行了全面解析。研究发现采用全二维色谱技术结合飞行时间质谱具有强分离能力和灵敏性，可以更有效的对复杂组分进行分析，较好的解决了一维气相色谱中共流出和无法检测到一些痕量物质的问题。通过对质谱库的检索及保留指数比对，在黄土高原产区赤霞珠葡萄酒中共鉴定出600种香气化合物，体现了葡萄酒香气成分的复杂性。其中挥发性组分以酯类、芳香族、萜烯类和醇类为主，此外还有醛酮类、含硫化合物、呋喃、内酯、吡嗪等化合物，这些物质共同作用形成了该产区葡萄酒的风味特征。但本研究只是对黄土高原产区赤霞珠葡萄酒中的化合物进行了鉴定分析，而其对葡萄酒风味的贡献还与其含量和阈值等有较大关系，同时本研究检测到了数量众多的萜烯类化合物和硫化物，这些化合物对于黄土高原产区赤霞珠葡萄酒独特的风味贡献均值得进一步探究。