长白山野生山葡萄酒挥发性成分分析

2020-01-13孙娜杨馨悦杨宇驰薛桂新

食品与发酵工业 2019年23期

孙娜，杨馨悦，杨宇驰，薛桂新

(延边大学农学院，吉林延吉，133000)

东北长白山野生山葡萄(VitisamurensisRupr.)属东亚葡萄种群，与赤霞珠、蛇龙珠和霞多丽等欧亚葡萄相比，粒小、皮厚、色浓、果香独特；有机酸、单宁、氨基酸、矿物质和白藜芦醇的含量较高，独特的生态条件决定了该地区野生山葡萄及葡萄酒的优良品质和独特风格[1]。野生山葡萄酒的研究始于20世纪70年代[2]，2000年时张文英等[3]对山葡萄酒的苦涩味进行了分析并提出控制措施。2004年李记明等[4]报道了中国野生山葡萄的挥发性成分主要是醇、酯、醛、酮等。2018年李悦等[5]研究了北冰红山葡萄酒的香气类型，认为酒精味的含量较高。目前对野生山葡萄酒风味成分的研究报道较少，对挥发性成分的风味特征尚不明确。

挥发性成分主要有醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、烃类等[6]，这些物质种类及其含量对葡萄酒的风味特征和质量起到重要影响[7-8]。葡萄酒的挥发性成分不仅受工艺条件、产地环境、葡萄品种的影响，还与葡萄酒的年份有关[9-10]。前人分别采用电子鼻结合固相萃取(solid phase extraction, SPE)气相色谱-质谱(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS) 联用技术和电子鼻结合固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)GC-MS联用技术测定了葡萄酒的挥发性成分并建立数据的相关性，突出了电子鼻结合GC-MS方法的优势[11-12]。

本文利用电子鼻和顶空固相微萃取(hea space solid phase micro extraction, HS-SPME)结合技术对2016年、2017年和2018年长白山野生山葡萄酒的挥发性成分进行检测，一方面进一步认识了野生山葡萄酒的种类及含量，并深入了解了不同年份野生山葡萄酒挥发性成分的差异；另一方面对长白山野生山葡萄酒风味和典型性的研究具有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：3个垂直年份(2016、2017和2018年)的酒样由吉林省长白娃健康科技有限公司提供，野生山葡萄原料均采自长白山区二道白河镇野生山葡萄产区。同一山地，葡萄的栽培技术、管理模式、采收期、酿造工艺等均保持一致。

2-辛醇(色谱纯GC≥99.5%)，上海源叶生物科技有限公司；C7～C23正构烷烃(色谱纯)，北京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PEN3型电子鼻仪器，德国AIRSENSE公司；7890B-5977B气相色谱与质谱联用仪；CTC三位一体自动进样器，美国Agilent；50/30 μm DVB/CAR on PDMS型萃取头，美国Agilent；TDZ5-WS型高速离心机，中国湖南湘仪实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 野生山葡萄酒加工流程

山葡萄→挑选脱粒→破碎→添加果胶酶→调糖→添加活化酵母→发酵→过滤→后发酵→陈酿→山葡萄原酒。

1.3.2 操作要点

挑选脱粒：挑选无腐烂变质、无变软、无病虫害的葡萄粒。

破碎：用对辊破碎机挤压葡萄使皮破裂出汁，按照100 g/t加入焦亚硫酸钾，并加果胶酶酶解。

调糖：加入一定量的白砂糖，调整果汁糖度使酒精度达到12度。

酵母活化：按照0.02%(质量分数)加入FERMOL ROUGE BAYANUS酵母，发酵前活化。

发酵：在20～25 ℃室温条件发酵7～10 d，过滤后进行后发酵，后发酵时间为5周左右。

陈酿：在15～20 ℃室温条件陈酿。陈酿过程中不进行苹果酸-乳酸发酵。

1.3.3 电子鼻测定方法

山葡萄酒在3 000 r/min的条件下离心10 min，取上层清液。待电子鼻测试数据稳定后，取5 mL葡萄酒清液置于40 mL顶空瓶中，静态平衡一段时间，在进样口放置0.45 μm滤膜，针头从采样瓶顶空刺入取样。每个年份取5个样品。电子鼻清洗时间、样品准备时间、检测时间经优化分别为240、5和100 s，电子鼻软件每1 s自动记录1次数据，表1为电子鼻传感器对应的敏感物质[13]。

表1 电子鼻传感器及对应的敏感物质Table 1 Electronic nose sensor and corresponding sensitive material

1.3.4 HS-SPME与GC-MS联用测定方法

1.3.4.1 挥发性风味物质的提取

固相萃取采用CTC三位一体自动进样器取样分析；取5 mL样液于顶空瓶中，以250 r/min、50 ℃条件振荡15 min，在50℃条件下萃取30 min后，进样分析，解析时间5 min。每个年份取2个样品，实验结果取2个样品的平均值。

1.3.4.2 色谱条件

色谱柱：DB-wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样温度：260℃；程序升温：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；载气：He(99.999%)；流量：1 mL/min；不分流模式进样。

1.3.4.3 质谱条件

接口温度：260 ℃；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电离方式：EI,70 ev；扫描方式：全扫描；质量范围：20～400。

1.4 数据分析

用电子鼻系统配套软件对数据进行主成分分析(principle component analysis，PCA)和线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)。其他数据分析用SPSS ver. 10.0 package program和Excel软件处理。

GC-MS检测结果通过NIST14谱库检索处理，当结合匹配度(≥80%)和保留指数RI值(≥800)时初步确定挥发性成分的名称。保留指数根据改进的Kovats法计算得到，通过C7-C23正构烷烃混标物的保留时间来计算未知化合物的RI值[14]。

以2-辛醇为内标物进行半定量分析，挥发性成分的质量浓度根据公式(1)计算[15]。

(1)

式中:X，香气物质的质量浓度,μg/L；A，测得的香气物质的峰面积；C，内标物的质量浓度,μg/L；A0，测得的内标物的峰面积

2 结果与分析

2.1 不同年份野生山葡萄酒PCA和LDA分析

通过SPSS对3个年份10个传感器的响应值进行主成分分析，得出第一主成分和第二主成分的表达公式。第一主成分=0.960ZS1+0.980ZS2+0.991ZS3+0.941ZS4+0.988ZS5+0.817ZS6+0.930ZS7+0.935ZS8+0.976ZS9+0.172ZS10。第二主成分=-0.253ZS1-0.140ZS2-0.065ZS3-0.123ZS4-0.067ZS5+0.192ZS6-0.150ZS7+0.258ZS8-0.080ZS9+0.974ZS10。

由图1可知，PCA分析的总贡献率为99.57%，远大于70%，说明该方法能够分析样品挥发性风味的主要特征[16]；而且年份相差越久，样品间距离越远，挥发性成分差异越大，并且差异主要体现在第一主成分上。由主成分表达式可知，传感器S1、S2、S3、S5和S9对第一主成分影响较大，结合表1说明3个年份中芳香成分、氮氧类、苯环类、3碳烷烃类、有机硫类等化合物均存在差异。

图1 不同年份年野生山葡萄酒的PCA分析结果Fig.1 PCA analysis results of wild mountain wines in different years

由图2可知，LDA分析的总贡献率为96.62%，说明用该方法分析样品挥发性的差异具有可行性。该分析结果与PCA分析结果一致。

图2 不同年份野生山葡萄酒的LDA分析结果Fig.2 LDA analysis results of wild mountain wines in different years

图1和图2显示，2017和2018年样品点相隔较近，而2016年与2017和2018年样品点相隔较远，说明野生山葡萄酒年份越久，挥发性成分的差异越大。

2.2 不同年份野生山葡萄酒挥发性成分

从表2和图3可知，在3个年份野生山葡萄酒中共检测挥发性成分153种，其中酯类有56种，醇类有30种，醛类2种，酮类11种，酸类5种，烃类25种，苯环类16种，其他类8种，其物质的种类与刘丽媛等[17]的研究结果类似，而李记明等[4]野生山葡萄酒的研究中没有发现苯环类物质。3年共有挥发性成分24种。

表2 不同年份野生山葡萄酒挥发性成分Table 2 Volatile components of wild mountain wines in different years

续表2

序号名称质量浓度/(μg·L-1)2016年2017年2018年风味特征匹配度RI值RI检索值27琥珀酸二乙酯160.57--清淡的葡萄味[30]931324.171723[42]28水杨酸甲酯23.13--香脂味[31]901352.131771[43]29亚氨基二碳酸,二乙酯7.06--871357.0630丁二酸羟基二乙酯106.07287.02-871388.4431亚砷酸三酯931399.75322-甲基,3-甲基丁酯-4.57-911409.1433辛酸甲酯7.517.8122.34柔软,苹果皮味[30]931419.101483[20]34氯甲酸辛酯59.13--971426.6635甲酸辛酯-30.74-香橙味[29]971437.3236辛酸乙酯555.59477.92274.89果香,菠萝,梨,花香[30]991442.051414[43]372-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)丙-2-基碳酸乙酯70.87--851458.5238乙酸2-苯乙基酯19.43--831529.991805[43]39癸酸甲酯--48.32蜡香,皂香,果香[31]991583.571584[43]40壬酸乙酯--42.17果香,玫瑰香[33]881603.651533[43]41己酸己酯--1.93苹果皮,桃味[20]971621.511723[20]42癸酸乙酯34.3322.66739.35脂肪味,果香,舒适的醋味[33]991652.411648[43]43十一烷酸乙酯--5.16椰子香[31]841758.621782[42]44戊二酸二酯55.75--861775.0045十二烷酸乙酯(月桂酸)--706.25花香,果香[33]931867.841843[43]46β-丙氨酸,N-甲基-乙酯-14.79-962005.5347琥珀酸2,4-二甲基戊-3-基异丁酯30.75--992013.3548十五烷酸,3-甲基丁酯--10.66微弱油香和脂香[35]832022.162092[41]49十四烷酸乙酯6.79-103.36椰子香,脂香[37]942086.132060[43]50十六烷酸乙酯94.6840.97266.7微弱蜡香,奶油香气[35]992201.072241[43]519-十六烯酸乙酯--15.56992221.442251[43]52丁二酸乙基甲基酯29.8421.7-822539.9653琥珀酸2-庚基乙基酯139.36--862736.4554十八烷酸乙酯20.37-5.61蜡香[35]992746.332247[43]55亚油酸乙酯--28.22902759.732531[43]56己二酸4-甲氧基-2-甲基丁基丙酯7.1--992761.19醇类57乙醇793.18593.75551.53刺激醇味,轻微药味[38]90955.73976[41]581-丙醇45.6131.3319.63具有淡淡的醇香[22]81965.121029[43]592-甲基-1-丙醇116.71107.0660.4790995.111083[43]60环丁醇6.254.833.1990993.3261异丁醇13.7114.9426.46苦味[20]981008.001094[43]621-丁醇25.17--酒精味[33]811003.981162[43]63异戊醇-0.750.8指甲油,威士忌味[33]981044.001214[43]643-甲基-1-丁醇1790.882127.32007.2有不愉快气味[35]861092.991201[44]651-戊醇6.83--杂醇油气味[38]861109.951254[43]66反式3-己烯-1-醇138.06--青草气味[31]831089.951360[43]671-己醇399.63218.67392.13青草味,土司味[33]971095.071350[43]683-己烯-2-醇,(E)14.04-8.35青叶香气[33]971108.6369顺式-3-己烯-1-醇113.98--青草气味[31]881129.001459[20]702-己烯-1-醇,(E)19.25--青苹果味[39]871146.6471反式3-庚烯-1-醇158.49--871171.47722-(1-甲基乙氧基)-1-丙醇-164.68-931175.59731,3-二氧戊环-4-甲醇--115.76811281.42742-辛醇406.4139.49蘑菇味[38]861293.081546[44]751-辛醇--31.55柑橘香,玫瑰花香,甜草药味[33]861305.021561[43]763,4-二羟基苯基乙二醇20.649.09-861314.31771-溴-7-辛醇10.41--851320.76

续表2

序号名称质量浓度/(μg·L-1)2016年2017年2018年风味特征匹配度RI值RI检索值784-甲基-4-庚醇-7.47-881330.81795-壬醇-36.38-821349.59802,6-二甲基-4-庚醇56.92--971369.421546[44]811-壬醇41.2833.31-强烈的水果清香,蔷薇香味[33]921376.151695[42]823-乙基-3-辛醇38.34--801494.87834-萜品醇14.44--951509.121559[20]84香茅醇11-13.49花香,柑橘香[35]801599.861883[20]852-甲基丙氧基醇231.4863.1-87862-(甲氨基)乙醇--30.2895醛类87乙醛146.5394.3540.55青草香,水果味[33]83944.271082[43]88糠醛-25.15-熏香味,果香,花香[33]831040.571452[43]酮类893-甲基-2-恶唑烷酮--8.2821011.56903-羟基-2-丁酮16.64--奶油味[20]971050.241342[20]918-壬烯-2-酮5.41--841532.07923H-吡唑-3-酮20.16--881643.0893α-紫罗兰酮18.79--香脂味,花味[21]801643.11942-庚烯-4-酮1026.83656.92248.65801681.1495反式2-丁烯-1-酮28.657.43-971711.61962-丁烯-1-酮-215.2315.5871710.9597大马士酮3--树皮味,甜苹果味[33]921711.641818[43]982,5-环己二烯-1-酮3.94--802017.36993-甲基-环庚酮,-3.22-91酸类100醋酸144.26--刺激性酸味[37]81818.011441[43]101丁酸11.27--奶油[31]839661627[43]102己酸35.1221.8731.96奶酪味,脂肪味[31]871095.691849[43]103辛酸5.168.7218.14酸臭味脂肪味[31]981623.412066[43]1041-环己烯-1-羧酸60.06--821633.74烃类105环丙烷41.31--87810.59106环戊烷15.86--90800.66107乙氧基-乙烯-6.28-90850.09108环己烯5.18--941058.771097-氧杂二环[2.2.1]庚烷4.39--871073.931102-丁氧基戊烷12.35--971075.591111,3,3-三甲氧基丁烷9.86--961093.081122-乙氧基丙烷15.01--911175.641133,4-二乙基-2-己烯2.42--801207.811142,3-二氢-1-氧代-1H-非那烯11.68--831209.67115双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯--10.99881309.861161,1-二乙氧基-3-甲基丁烷13.2--801319.041062[34]1173-甲基-1-辛烯--8.69831338.501189-硼双环[3.3.1]壬烷50.42--851446.421221[42]119d柠檬烯11.8--有类似柠檬的香味[35]971478.56120邻伞花烃19.91--851556.57121双环(4.4.0)癸烷-5.33--901690.121237[43]1221,1-二乙氧基乙烷-415.23-831649.38889[36]1231,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷1.74--831673.841289[34]124十三烷13.657.9511.42801680.211387[34]125十四烷11.8711.399.31801687.60126十五烷9.025.967.68831676.93

续表2

序号名称质量浓度/(μg·L-1)2016年2017年2018年风味特征匹配度RI值RI检索值127丁香烯33.75--971855.561281,3,2-二氧杂硼杂环戊烷--16.81832061.401291,3-二氧杂环庚烷-20.17-832052.72苯类130苯酚294.1876.916.63似胶水,墨汁[40]931007.901970[32]131苯甲醇63.87--苦杏仁味[33]931091.041879[43]1324-甲氧基-苯酚-82.48-951153.742081[44]133苯甲酰溴-72.169.41881107.751342-丙烯基-苯73.18--891153.74135甲硫基-苯24.26149.45-871217.75136苯乙醇890.11.85-淡雅清幽的玫瑰花香味[33]951234.121929[43]137苯乙烯-119.36-芳香气味[38]931282.651296[42]1382-氯乙氧基苯4.71--971302.751392-(1-甲基-2-丁烯基)-4-甲氧基-苯酚-24.3811316.97140苯甲酸乙酯65.15--果香[35]931470.241651[44]141苯甲醛43.63-34.84苦杏仁味[38]981507.751510[43]1421-甲基乙基苯175.1--881564.081434-烯丙基-2-甲氧基苯酚3.02-65.84871567.371442,4-二叔丁基苯酚57.64-4.23891897.502279[44]1451-(1,5-二甲基-4-己烯基)-4-甲基-苯10.73--882726.66其他146二甲基二硫化物-4.59-998291011[41]147丙氨酰甘氨酸62.24--84976.11148二异丙醚15.55--861005.401491,5-二甲基-1H-咪唑48.92--861341.521502-乙烯基四氢呋喃10.86--851497.401526[41]1512-肼基-4,6-二甲基嘧啶-13.39-961514.81152吗啡-双(三甲基甲硅烷基)醚7.5--801561.531531,1,5-三甲基-1,2-二氢化萘-19.72-861649.57

注：“-”表示未检测出。

图3 不同年份野生山葡萄酒挥发性成分质量浓度比较Fig.3 Comparis on of the concentration of volatile components in wild mountain wines in different years

2016年检出挥发性物质104种，质量浓度为12 296.62 μg/L；2017年检出64种，质量浓度为9 666.88 μg/L；2018年检出59种，质量浓度为8 144.12 μg/L，由此可见，山葡萄酒年份越久，挥发性物质种类和质量浓度越多，香气更加饱满。

2.2.1 酯类物质分析

酯类化合物对提升葡萄酒香气复杂性至关重要，被认为是葡萄酒香气的重要贡献者，也是葡萄酒果香主要来源之一[18-19]。发酵香气中酯类大部分是酵母等微生物活动产生的中性酯，类似水果香气[20]。由表2可知，2016年检出酯类物质32种，质量浓度为4 528.05 μg/L；2017年检出香气物质26种，质量浓度为4 207.06 μg/L；2 018年检出香气物质27种，质量浓度为4 004.28.12 μg/L。可见山葡萄酒酯类物质的种类和质量浓度所占比例较大，对野生山葡萄酒风味的贡献不容忽视。

2.2.2 醇类物质分析

高级醇又称杂醇油，是酵母在发酵过程中形成的代谢副产物，对葡萄酒的风味和品质有重要影响，杂醇油含量适中，葡萄酒不仅香气优雅，而且会增加酒体的协调性；若含量过高则会带来异味，并易使人头疼和醉酒[21]。表2中2016年检出醇类物质23种，质量浓度为4 106.40 μg/L；2017年检出香气物质15种，质量浓度为3 419.04 μg/L；2018年检出香气物质14种，质量浓度为3 330.33 μg/L。可见山葡萄酒年份越久生成的高级醇越多；醇类物质的种类和质量浓度仅次于酯类物质，也是野生山葡萄酒重要的挥发性成分之一。

2.2.3 醛类、酮类、酸类、烃类、苯环类和其他类物质分析

醛类、酮类、酸类、烃类、苯环类和其他类物质对山葡萄酒的风味也具有重要作用，主要起到补充和修饰的作用。表2中2016年、2017年和2018年野生山葡萄酒酮类分别检出7、4和3种，共有物质为2-庚烯-4-酮。酮类物质主要呈现桉叶味、脂肪味和焦燃味，且酮类香气成分贡献率较高[22]，可能会增加野生山葡萄酒风味的醇厚感。适量的酸会增加葡萄酒的滋味与口感，还会参与酯化反应，赋予葡萄酒水果香气[23]。表2中2016年、2017年和2018年分别检出5、2和2种酸类物质，2016年酸类的质量浓度和种类均高于其它2年；烃类物质芳香成分贡献率较低[24]，虽然含量丰富但对样品风味贡献率较小，有些杂环化合物的重要中间体有利于提升葡萄酒的整体风味品质。表2中2016年、2017年和2018年分别检出烃类19、6和6种，苯环类12、6和6种，其他类4、3和0种，质量浓度均较低，对风味贡献不大。

综合来看，野生山葡萄酒的年份不同，呈现的风味也不同，其中酯类和醇类物质是主要的风味成分；随着年份的增加，其风味更加丰富浓郁。这一结果与张众[25]、席艳如[26]和郭松年[27]等人的研究结果大体一致。而蒋宝等[28]对黄土高原不同地形的赤霞珠葡萄进行挥发性成分分析，得出醇类是主要成分，其次是酯类和脂肪酸类，与本文结果略有不同。