乳腺癌细胞CD44+CD24-/low 亚群化疗药物外排作用研究

孙洪光 孝飞飞 贾中明 王希龙 张国强 杨振林

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,严重危害着广大女性的健康［1］。化疗是乳腺癌治疗常用的治疗方式之一,但其疗效却一直受到多药耐药(multidrug resistance,MDR)的限制。乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)被认为是在肿瘤细胞中极少部分具有干细胞的特性的细胞亚群,虽只占极少部分,但却是肿瘤发生、发展与转移的根源。既往研究发现,经化疗治疗后,乳腺癌细胞中BCSCs 的比例较化疗前有了明显的提高［2］,而跨膜蛋白引起的化疗药物外排是提高细胞对化疗药物耐受的重要途径。为此,本实验拟采用MACS 分选获得CD44+CD24-/low细胞亚群,测定其对化疗药物的外排作用,并检测其药物外排相关蛋白的表达水平,探究其与多药耐药的关系,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 多药耐药MCF-7/ADR 细胞株为本实验室低剂量缓慢诱导法所得,RPMI1640 培养基购自Gibco 公司,胎牛血清购自Hyclone 公司,阿霉素购自Invitrogen 公司,MTT 购自Sigma 公司,鼠抗人P-gp-PE、鼠抗人CD24-FITC、兔抗人CD44-PE 均购自eBioscience 公司。主要仪器：流式细胞仪(美国Becman Coulter 公司)、激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)、MACS 分选系统(德国Miltenyi 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7/ADR 细胞株于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液中培养,保持37℃,5%CO2饱和湿度培养。为维持细胞株的耐药性,培养基中阿霉素浓度保持为1 mg/ml。试验开始前2 周,改用无药物完全培养基培养。

1.2.2 MACS 分选CD44+CD24-/low亚群 取生长状态良好的细胞,制备单细胞悬液,计数,1000 r/min 离心10 min,弃上清,重悬,每1×107细胞加入10 μl 的CD24-Biotin,混匀,低温孵育15 min,重悬,加入20 μl的Anti-biotin MicroBeads,混匀,低温孵育15 min,于500 μl 的缓冲液中重悬,应用MACS 分选系统阴性分选CD24-/low细胞。按同样步骤阳性分选上步分选所得CD24-/low细胞,获取CD44+CD24-/low亚群。

1.2.3 流式细胞仪检测分选前后CD44+CD24-/low细胞比例 取生长状态良好的细胞,磷酸缓冲液(PBS)洗涤,以2×107/ml 细胞浓度重悬,取50 μl 单细胞悬液,加入含5 μl 鼠抗人CD24-FITC 和0.625 μl 兔抗人CD44-PE的流式缓冲液50 μl,4℃孵育30 min,缓冲液洗涤2 次,应用流式细胞仪检测P-gp 表达水平,激发光波长为488 nm,应用EXPO32 ADC Analysis 软件进行结果分析。

1.2.4 MTT 法检测化疗药物敏感程度 取MCF-7/ADR细胞及CD44+CD24-/low亚群,调整浓度为1×104/ml,每孔100 μl 接种于96 孔板,37℃,5%CO2培养过夜,实验组加入梯度浓度阿霉素,对照组未加阿霉素处理,每组设3 个复孔,继续培养24 h,每孔加入20 μl 浓度5 mg/ml 的MTT 溶液,培养4 h,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,震荡10 min,在560 nm 处读取OD 值。按公式计算：抑制率(%)=(对照组OD 值-实验组OD 值)/对照组OD 值×100%,SPSS20.0 计算IC50。

1.2.5 激光共聚焦显微镜下观察胞内阿霉素蓄积取MCF-7/ADR 细胞及分选所得CD44+CD24-/low亚群,调整浓度,种板,37℃,5%CO2培养过夜。PBS 冲洗玻片3 次,加入2 mg/ml 阿霉素,37℃,5%CO2培养1 h,PBS 冲洗,4%多聚甲醛溶液固定15 min,甘油封片。应用激光共聚焦显微镜观察胞内荧光强度,留取图片。各参数保持统一,选细胞数量相近的视野拍照,应用Image-pro Plus 6.0软件定量分析胞内化疗药物蓄积水平。

1.2.6 流式细胞仪检测P-gp 表达水平 取状态良好的细胞,PBS 洗涤2 次,重悬,调整细胞浓度为2×107/ml,于95 μl 悬液中加入5 μl 鼠抗人P-gp-PE,4℃避光孵育30 min,缓冲液洗涤2 次,上机检测P-gp表达水平,激发光波长为488 nm,应用EXPO32 ADC Analysis 进行结果分析。

1.3 观察指标 分析MACS 分选CD44+CD24-/low亚群结果,分选前后CD44+CD24-/low细胞比例,CD44+CD24-/low亚群对化疗药物的敏感性,CD44+CD24-/low亚群胞内化疗药物蓄积,CD44+CD24-/low细胞亚群的P-gp表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MACS 分选CD44+CD24-/low亚群结果分析 MACS分选前后分别计数细胞数量,被分选出来的CD44+CD24-/low细胞比例约为6%。

2.2 流式细胞仪检测分选前后CD44+CD24-/low细胞比例结果分析 MCF-7/ADR 细胞中CD44+CD24-/low细胞比例为6.21%,与分选所得CD44+CD24-/low细胞比例相符。经流式细胞仪检测,分选所得 CD44+CD24-/low亚群中CD44+CD24-/low细胞比例约为93.85%,达到进一步相关试验要求。

2.3 CD44+CD24-/low亚群对化疗药物的敏感性CD44+CD24-/low亚 群 的IC50 为(17.37±0.46)mg/ml,MCF-7/ADR 细胞的IC50 为(15.84±0.66)mg/ml,比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 CD44+CD24-/low亚群胞内化疗药物蓄积 激光共聚焦显微镜下观察发现,MCF-7/ADR 细胞及分选所得CD44+CD24-/low亚群均具有较强的药物外排作用,阿霉素多集中于细胞核膜表面内侧,在细胞核中心阿霉素蓄积较少。MCF-7/ADR 细胞较CD44+CD24-/low亚群胞内蓄积更高浓度阿霉素,荧光强度分别为(571.67±11.15) 和(518.67±11.93),比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 CD44+CD24-/low细胞亚群的P-gp 表达水平CD44+CD24-/low细胞亚群P-gp 表达荧光强度为(114906.70±2560.19),MCF-7/ADR 细胞P-gp 表达荧光强度为(101177.10±2171.86),比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

肿瘤干细胞被认为具有自我更新、无限增殖以及多向分化能力,是肿瘤的发生、发展与转移的根源。2003 年,Al-Hajj 等［3］发 现CD44+CD24-/low亚群具有干细胞特性。目前普遍将CD44+CD24-/low作为最为常用的BCSCs 分选标志。本实验应用MACS 分选获得CD44+CD24-/low亚群,进一步应用流式细胞仪检测其比例,结果示＞90%,符合进一步实验要求。

化疗是乳腺癌治疗的重要手段,但肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药是制约化疗疗效的重要因素,严重影响了治疗效果。多药耐药的发生机制较为复杂。P-gp 可依赖ATP 供能将药物从细胞内泵出到细胞外,从而使肿瘤细胞躲避化疗药物的杀伤［4］。有研究发现,沉默P-gp 表达可大大提高阿霉素的治疗效果［5］。编码P-gp 表达的多药耐药1 基因表达水平与乳腺癌耐药性存在重要关系［6］,抑制多药耐药1 表达可使MCF-7细胞系对药物敏感性提高。

本研究证实,与MCF-7/ADR 细胞相比,阿霉素对CD44+CD24-/low亚群的杀伤能力更弱,IC50 高于MCF-7/ADR 细胞。通过激光共聚焦显微镜成像检测,MCF-7/ADR 细胞及CD44+CD24-/low亚群均具有较强的阿霉素外排能力。进一步分析表明,CD44+CD24-/low亚群内蓄积的阿霉素明显少于MCF-7/ADR 细胞,说明药物外排作用可能是BCSCs 拥有更强化疗药物抵抗能力的直接原因。本研究显示,与一般肿瘤细胞比较,CD44+CD24-/low亚群细胞膜的P-gp 表达水平更高,P-gp作为跨膜蛋白家族的重要成员,在化疗治疗过程中,该亚群可以把更多的化疗药物从细胞内泵出到细胞外,从而影响化疗治疗的效果,也是乳腺癌治疗过程中的一个难题。由此可见,CD44+CD24-/low亚群对于化疗药物具有较强的跨膜转运能力,能把化疗药物从细胞内泵出到细胞外,从而躲避化疗药物对肿瘤细胞的杀伤,可能是造成BCSCs 化疗抵抗的主要原因。

综上所述,CD44+CD24-/low亚群具有更强的药物外排能力,可将更多的化疗药物排到胞外,不易被化疗药物杀伤,从而影响治疗效果。如何有效减少BCSCs 对化疗药物的外排作用,增加化疗药物对其杀伤作用,成为今后乳腺癌治疗研究的重要研究方向。