化学发光免疫分析法检测乙肝病毒感染性标志物的价值评价

郑赫

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV) 传播途径广泛,且感染率极高［1］,患者一旦感染此病毒,随着时间推移会逐渐发展为急性肝炎、慢性肝炎,严重者会发展成为肝硬化等疾病,给患者身心都带来很大伤害［2］。如果可以及时诊断出乙肝病毒是否感染,可以通过治疗有效缓解患者痛苦,并降低传染率［3］。目前临床上用于此项鉴定的方法主要有ELISA法,其可以对乙肝病毒感染性标志物进行定性分析,但是无法进行准确定量。CLIA 法有效结合了化学发光反应与免疫反应,其具有灵敏度高可以快速定量分析的优势,从而弥补了ELISA 法存在的缺陷［4］。本文详细分析了 ELISA 法和CLIA 法对乙肝病毒血清标志物的检测结果,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2017 年10 月～2018 年12 月收治的300 例乙肝患者作为研究对象,其中男180 例,年龄18～77岁,平均年龄(45.43±12.6)岁；女120例,年龄18～74岁,平均年龄(44.43±12.3)岁。所有患者均符合《WS299-2008乙型病毒性肝炎诊断标准》。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 离心机(型号：SV-II,山东博科科学仪器有限公司)、全自动酶免分析仪(型号：Bosal,上海通达生物科技有限公司)、化学发光法检测仪(型号：HISCL-5000,日本希森美康公司)。

1.2.2 试剂 ①ELISA 试剂盒：HBsAg(武汉博士康生物工程有限公司,国 药准字3400915,批 号C20161124、C20161125、C20161126)；HBeAg(上海领潮生物科技有限公司,国 药准字3400525,批 号201609381、201609382、201609383)；HBeAb(上海领潮生物科技有限公司,国药准字3400526,批号201610121、201610123),HBsAb(武汉博士康生物工程有限公司,国药准字3400526,批号201610181、201610184),HBcAb(武汉博士康生物工程有限公司,国药准 字3400526,批 号201610036、201610027)；②CLIA 剂盒：HBsAg(希森美康株式会社,国械注进20183401932,批号ZS8114、ZS8116)；HBeAg(希森美康株式会社,国械注进20183401629,批号EG2012、EG2014)；HBeAb(希森美康株式会社,国械注进20183401671,批号EB2011、EB2013)；HBsAb(希森美康株式会社,国械注进20183402425,批号SB2016、SB2018)；HBcAb (希森美康株式会社,国械注进20183401669,批号CB2014、CB2016)。

1.3 方法

1.3.1 血清处理 抽取患者早餐空腹静脉血,随后使用离心机于3500 rpm 离心15 min 后分离出血清。

1.3.2 ELISA 法 采用ELISA 试剂盒以及酶标仪进行检测,一定要严格按照试剂盒说明及酶标仪的仪器说明进行操作,正式样品测定同时要测定不同浓度的标准品作为最终的参照,质控选取定值参比血清,标本分别测定 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 共5 项指标。

1.3.3 CLIA 法 采用CLIA 试剂盒进行检测,严格按照试剂盒要求进行,测定指标与ELISA 方法相同,同样需要测定不同浓度的标准品作为最终的参照,质控选取定值参比血清。

1.4 观察指标及判定标准 对比、分析ELISA 法及CLIA法乙肝病毒感染性标志物的检测结果。①ELISA 的阳性判定标准：测定值≥上限参考值；HBsAg 参考值上限为0.2 ng/ml,HBsAb 上限参考值为10.0 mIU/ml,HBeAg 上限参考值为0.05 NCU/ml、HBeAb 上 限 参 考 值 为2.0 NCU/ml、HBcAb 的上限参考值为1.5 NCU/ml［4］。②CLIA 的阳性判定标准为：测定值≥上限参考值,其测定参考值同①。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法的检测结果对比 标准样本的回收率均在标准规定范围内,此次检测有效。300 例患者中,ELISA 法检测HBsAg 阳性198 例(66.00%),HBsAb 阳性115 例(38.33%),HBeAg 阳 性247 例(82.33%),HBeAb 阳 性289 例(96.33%),HBcAb 阳 性221 例(73.67%)；CLIA 法 检 测HBsAg 阳 性231 例(77.00%),HBsAb 阳 性161 例(53.67%),HBeAg 阳 性289 例(96.33%),HBeAb 阳 性290 例(96.67%),HBcAb 阳 性257 例(85.67%)。两种方法HBeAb 阳性检出率对比差异无统计学意义(P＞0.05)；CLIA 法HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAb阳性检出率高于ELISA 法,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 两种方法的检测结果分析 本次检测中,两种方法检测同时为阳性：HBsAg 198 例,HBsAb 115 例,HBeAg 247 例、HBeAb 289 例、HBcAb 221 例；CLIA 法检测为阳性但ELISA法检测为阴性：HBsAg 33 例,HBsAb 46 例,HBeAg 42 例,HBeAb 1 例,HBcAb 36 例。CLIA 法检测阳性的HBsAg 33 例中有32 例属于低水平测定结果(平均值为0.3 ng/ml),HBsAb 46 例有40 例属于低水平测定结果(平均值为10.5 mIU/ml),HBeAg 42 例有39 例属于低水平测定结果(平均值为1.06 NCU/ml),HBcAb 36 例有35 例属于低水平测定结果(平均值为1.52 NCU/ml)。当测定值显著大于上限值时,ELISA 方法与 CLIA 法的阳性检出率基本一致,CLIA 方法的检出限显著低于ELISA 法,低浓度时其敏感度更高。

3 讨论

乙肝病毒是引起乙肝的病原体,其属于嗜肝DNA 病毒科,该科病毒包含正嗜肝DNA 病毒属和禽嗜肝DNA 病毒属,引起人体感染的是正嗜肝DNA 病毒属。乙肝病毒的感染是目前难以解决的全球性的公共卫生问题之一。其主要传染源为急性乙肝患者、慢性乙肝患者和乙型肝炎病毒携带者,乙型肝炎病毒感染者的血液无论是处于潜伏期还是急性期或慢性期都具有传染性［5］。HBsAg 阳性持续6 个月以上,没有肝炎症状的体征,肝功能等各项检查都显示正常,血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)均在正常范围,肝组织检查显示没有明显的异常症状称为乙肝病毒携带者。慢性患者和病毒携带者作为传染源的意义最大,其传染性与病毒复制或体液中乙肝病毒的DNA 含量呈正比［6］。乙肝病毒主要的传播途径是血液传播,其次是母婴传播,乙肝患者中通常有40%～50%的患者均来源于母婴传播,再次是密切接触传播,最后是医源性传播,如消毒不彻底、不安全注射等。

乙肝病毒的主要致病机理与肝细胞受损程度以及机体免疫应答的强弱有关,当病毒致机体免疫应答低下时,一旦发生乙肝病毒感染对外膜抗原的体液抗体应答利于清除血液中的病毒颗粒,对核壳和复制酶抗原的细胞免疫应答清除病毒的同时也损害肝细胞。其次,病毒变异产生耐药性时,病毒会发生变异后的免疫逃逸,乙肝病毒在感染过程中由于人体免疫压力和抗乙肝病毒药物的影响易诱发变异,乙肝病毒变异后,可造成病毒不易清除并引起耐药,降低抗病毒治疗的疗效。最后,抗体介导的免疫病理损害如HBsAb、前S1 抗体(PreS1-Ab)和前S2 抗体(PreS2-Ab)可直接清除血循环中游离的病毒,但抗原抗体形成的免疫复合物可沉积于肾小球基底膜、关节滑液囊等处并激活补体,引起Ⅲ型超敏反应,从而导致急性肝坏死,表现为重症肝炎［7］。

常用的乙肝病毒感染的检测指标即乙肝5 项：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb,可以在很大程度上反映被检者体内乙肝病毒水平及机体的反应情况,粗略评估病毒的水平［8］。乙肝五项检测分为定性和定量两种,定性检查只能提供阴性或阳性结果,定量检查则可提供各项指标的精确数值,对乙肝患者的监测、治疗评估和预后判断等方面有更重要的意义,动态监测可作为临床医师制定治疗方案的依据。

ELISA 法就是一种定性的方法,其反应机理是试剂可以使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA 可用于测定抗原,也可用于测定抗体。其重要的试剂种类为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体以及酶作用的底物(显色剂)。CLIA 包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(称为CLIA)或抗体(称为免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。因此其反应原理的不同导致了其具有不同的灵敏度和检测限。除去反应原理不同,两种方法检测过程也有很大区别,ELISA 法中手动加样、孵育时间的确定以及手动洗板等因素可能会因为人员手法的不同从而导致结果具有差异性。

综上所述,CLIA 法检测分析检测乙肝病毒感染性标志物时敏感度更高,检测结果更准确。