中性粒细胞胞外诱捕网抗疣状毛癣菌感染的作用研究

张秀军 郭艳阳 朱振来 薛小文 马翠玲 王刚 付萌

(第四军医大学西京皮肤医院，西安 710032)

中性粒细胞是免疫系统的重要成员，在识别和清除真菌过程中起着不可或缺的作用，以往认为中性粒细胞主要通过吞噬、脱颗粒作用来抵抗病原入侵[1]。然而对于体积太大而不能被吞噬的真菌细胞，中性粒细胞可以通过产生NETs的形式参与抗真菌免疫[2]。NETs是中性粒细胞在受到病原体刺激后，释放出来的以细胞核解聚染色体构成骨架，镶嵌多种来自细胞内的有杀菌作用颗粒蛋白的网状结构。这些具有杀菌作用的蛋白主要包括瓜氨酸化的组蛋白H3(Citrullinated histon H3, Cit H3)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、中性粒细胞弹力蛋白酶(Neutrophils elastase, NE)、钙防卫蛋白等[3]。已有报道中性粒细胞通过形成NETs在抵御白念珠菌[4]、烟曲霉[5]等真菌免疫过程中发挥重要作用。

T.verrucosum感染常导致强烈的炎症反应[6]，患者局部组织常见大量中性粒细胞浸润[7-8]，可能参与机体抗T.verrucosum免疫，但具体机制不清。我们观察到1例T.verrucosum感染患者局部组织大量中性粒细胞浸润，但T.verrucosum能否诱导NETs形成及NETs是否参与抗T.verrucosum免疫还不清楚。我们首先观察T.verrucosum感染患者组织及T.verrucosum感染小鼠组织中是否存在NETs，进一步将T.verrucosum与中性粒细胞共培养观察其是否诱导NETs的形成，并检测NETs对T.verrucosum是否具有杀伤作用。

1 材料和方法

1.1 材料

仪器 激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss公司，德国)；CFX384荧光定量PCR(BIO-RAD公司，美国)；比浊仪(生物梅里埃公司，法国)。

主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar, PDA)(美国BD公司)；Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基(HyClone公司，美国)；真菌DNA提取试剂盒与引物ITS1/ITS4合成(上海生工公司)；PMA(MedChemExpress公司，美国)；小鼠抗人MPO(ab25989)、兔抗人CitH3(ab5103)、兔抗小鼠NE(ab68672)抗体(Abcam，美国)；小鼠抗小鼠CitH3抗体(14269s,Cell Signaling公司，美国)；FITC-羊抗小鼠IgG抗体(CW0113，北京康为世纪生物科技有限公司);CY3-羊抗兔IgG抗体(EK022，西安壮志生物科技有限公司)；PKH26红色荧光细胞标记试剂盒、卡尔科弗卢尔荧光增白剂(SIGMA公司，美国)；SYTOX Green染料(赛默飞世尔公司，美国)；SYBR Premix Ex TaqII(TAKARA公司，日本)

实验动物 8周龄雄性近交系BALB/C小鼠购买及饲养于第四军医大学动物实验中心，培养于恒温恒湿的SPF级屏蔽环境内。

细胞 抽取健康志愿者外周血，通过密度梯度离心法提取中性粒细胞，无血清 RPMI培养基重悬。细胞涂片吉姆萨染色，镜下随机选择5个不同视野分析，纯度为(94±2.92)%。血细胞计数仪调至浓度1×106/mL的细胞悬液备用。

1.2 方法

菌株制备 取患者毛囊内容物进行真菌培养，以PDA平板上培养的单个菌落进行分子鉴定，采用上海生工公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，真菌特异性引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。产物送上海生工公司序列测定。测序结果显示产物大小为611 bp，在PubMed上进行blast比对鉴定为T.verrucosum。T.verrucosum接种于PDA试管培养基，37℃培养14 d，加生理盐水刷取菌落，液体加入研磨器充分研磨后使用比浊仪调浓度，分别制成麦氏浊度2.0、4.0的菌液备用。

T.verrucosum感染患者组织NETs检测 石蜡包埋患者组织切片脱蜡后经热处理修复抗原，山羊血清固定液固定，一抗用预混匀鼠抗MPO(1∶200)抗体与兔抗CitH3(1∶200)抗体，4℃湿盒过夜。PBS洗3遍，避光添加预混匀FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶200)和CY3标记的羊抗兔IgG(1∶200)，封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜观察。

T.verrucosum感染小鼠组织NETs检测 现配制的浊度2.0T.verrucosum菌液500 μL注射小鼠背部皮下，1 d后脱颈椎处死，局部组织以10%福尔马林固定过夜后石蜡包埋切片，染色及观察方法同患者组织切片，其中，一抗用兔抗NE抗体(1∶400)和鼠抗CitH3抗体(1∶400)，二抗用CY3标记的羊抗兔IgG(1∶200)和FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶200)。

体外T.verrucosum诱导中性粒细胞产生NETs检测 根据说明书用PKH26将中性粒细胞标记为红色，染色后细胞悬液每孔1 mL加入6孔板，添加100 μL浊度4.0T.verrucosum菌液，37℃、5%CO2孵育4 h后加入SYTOX Green(终浓度10 μmol/L)、真菌荧光染料Calcofluor White Stain(50 μL/mL)，5 min后激光扫描共聚焦显微镜观察NETs的形成。

NETs杀伤T.verrucosum根据以往文献报道[9]，中性粒细胞以1×106/孔接种于6孔板，添加佛波酯(PMA)100 nmol/L，37℃、5% CO2孵育4 h诱导NETs。小心移去培养基，位于孔底的细胞层用2 mL PBS轻柔洗2遍，每孔加入RPMI 1 mL备用。在PMA诱导NETs的6孔板中，每孔加入浊度4.0菌液100 μL，空白孔中加等体积菌液与培养基作为阴性对照，每孔设3个复孔，37℃、5% CO2孵育24 h，重悬后离心，沉淀采用上海生工公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。根据以往文献报道[10]，以ITS1/ITS4为引物，实时荧光定量PCR定量检测，步骤参照SYBR Premix Ex TaqⅡ说明书，反应终点读取达阈值荧光量的循环数(Cq)，以对照组值为1，相对定量样本中真菌数量，实验重复3次。

1.3 统计分析

用graphpad 8.0软件统计分析及制图，两组间的均值比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料

患者男，57岁，从事养殖业，因“面、颈部红色丘疹、丘脓疱疹、瘙痒3个月”就诊于我科。3个月前无明显诱因患者面部、颈部出现红色丘疹、丘脓疱疹，渐增多，伴瘙痒，部分胡须脱落。就诊于当地医院未见好转(具体诊治不详)。患者所饲养牛有脱毛、斑块表现。既往史、个人史无特殊。系统检查未见异常。皮肤科检查：面、颈部见散在多个直径约0.3 cm红色丘疹，部分表面见脓疱，对称分布，以口周、下颌胡须部位为著(见图1a、b)。辅助检查：血常规、肝功、肾功、血脂等未见明显异常。刮取毛囊内容物真菌镜检示：透明、分枝、分隔菌丝、链状厚壁孢子(见图1e、f，红色箭头示链状厚壁孢子)。毛囊内容物真菌培养：菌落在37℃比28℃生长更快(见图1g、h)，起初质地光滑，后绒毛状，表面呈白色，边缘为淡黄色(见图1i)。真菌测序鉴定菌种为T.verrucosum。患者所饲养牛皮损刮片，体外培养真菌测序亦为T.verrucosum。左下颌丘疹处组织病理：Hematoxylin-eosin(HE)染色示毛囊口扩张，真皮部分毛囊破坏，毛囊破坏处以及未破坏毛囊周围大量中性粒细胞，少量嗜酸性粒细胞浸润(见图1j、k)；Periodic Acid Schiff(PAS)染色：扩张毛囊口见菌丝及孢子(见图1l，黑色、红色箭头所指分别为菌丝、孢子)。

图1临床资料a和b：治疗前；c和d：治疗后；e和f：毛囊内容物直接镜检(×400);gi:毛囊内容物真菌培养，g、h和i分别为PDA 28℃培养3周，PDA 37℃培养3周，PDA 37℃培养2周；jl：组织病理(j、k和l分别为HE染色×25，HE染色×200，PAS染色×400)。

Fig.1Clinical data a and b: Before treatment. c and d: After treatment； e and f: Direct microscopic examination of hair follicle contents (×400)； gi: Fungi was cultured from hair follicle contents ( g, h and i respectivelyT.verrucosumcultured in PDA medium at 28 ° C for 3 weeks, cultured in PDA medium at 37 ° C for 3 weeks, and cultured in PDA medium at 37 ° C for 2 weeks)；jl: Histopathology ( j, k, and l were HE staining × 25, HE staining × 200, PAS staining × 400, respectively).

根据典型表现、组织病理、真菌体外培养及测序结果，诊断：须癣。予伊曲康唑胶囊0.2 g，每日2次口服，外用硝酸舍他康唑乳膏，2周后，根据真菌培养结果考虑可能为毛癣菌属，伊曲康唑胶囊调整为盐酸特比萘芬片250 mg，每日1次口服，5周后皮疹明显好转，3月后皮疹消退无复发，自行停药(见图1c、d) 。

2.2 T. verrucosum感染组织NETs检测

对患者组织免疫荧光染色，检测到与DNA共定位的NETs相关蛋白CitH3、MPO或NE，表明NETs形成(见图2，白色箭头所示)。同样的，用T.verrucosum感染小鼠1 d的组织中可见明显NETs。

图2 免疫荧光检测T. verrucosum感染患者(×40)及小鼠(×40 )组织NETs

2.3 T. verrucosum诱导中性粒细胞产生NETs的效果

以T.verrucosum体外刺激中性粒细胞4 h，T.verrucosum被真菌荧光染料标记成蓝色(白色箭头示菌丝)，且菌丝结构清晰。中性粒细胞被PKH26标记为红色。SYTOX Green为不渗透细胞膜的核酸染料，中性粒细胞释放到细胞外的核酸被SYTOX Green标记成绿色，并呈典型的纤维网状结构。这些结果表明T.verrucosum体外可诱导中性粒细胞NETs形成。特别是，如黑色箭头所指，中性粒细胞产生的NETs主要聚集在菌丝周围(见图3)。

2.4 NETs对T.verrucosum的杀伤作用

T.verrucosum与NETs共孵育24 h，实时荧光定量PCR定量检测NETs杀伤组与对照组真菌数量。结果显示，与对照组比较，NETs杀伤组相对真菌数量降低，差异有统计学意义(P<0.01，见图4)。

3 讨 论

在发现NETs前，中性粒细胞如何杀伤真菌这一类无法吞噬的大型病原体一直是个谜。NETs的发现为认识细胞外杀伤真菌提供了新途径[11]。

图3T.verrucosum诱导中性粒细胞产生NETs：T.verrucosum与中性粒细胞共培养4 h，免疫荧光检测NETs的形成(×10)。图4NETs对T.verrucosum的杀伤作用(**P< 0.01)

Fig.3Detection ofT.verrucosuminduced neutrophil production of NETs：T.verrucosumwas co-cultured with neutrophils for 4 h, immunofluorescence was used to detect the formation of NETs (×10).Fig.4Killing ofT.verrucosumby NETs(**P< 0.01)

研究证实，当真菌入侵时，中性粒细胞通过产生NETs发挥清除真菌作用。我们在T.verrucosum感染患者组织中发现大量中性粒细胞浸润，提示T.verrucosum感染后，中性粒细胞通过聚集至感染灶，可能为形成NETs创造条件。通过检测DNA及与NETs相关蛋白共定位，我们发现，T.verrucosum感染患者组织及T.verrucosum感染1 d后的小鼠组织存在明显NETs。进一步将T.verrucosum与中性粒细胞共培养4 h，可诱导中性粒细胞产生明显NETs，并呈典型的网状形态。以上实验表明，T.verrucosum可以有效诱导中性粒细胞产生NETs。

NETs的网状DNA结构是其行使功能的基础，用DNase破坏DNA骨架后，NETs的杀灭病原能力明显下降[12]。值得注意的是，我们在体外诱导实验中发现，NETs主要聚集在菌丝周围，对菌丝呈包围、笼络趋势。这体现了NETs控制真菌感染的重要途径之一，也体现了胞外诱捕网独特的功能，即通过网状结构在细胞外形成对真菌的物理屏障，诱捕、绑定真菌，限制扩散，阻止真菌感染进展，有利于进一步杀灭真菌，亦可能与其他聚集到感染灶的免疫细胞发挥协同作用[2]。

捕获入网后，除了物理屏障功能，由于主链上连接有磷酸二酯键，DNA本身就具有强力杀菌作用[13]。此外，NETs还通过强力抗菌蛋白在局部形成高浓度的杀菌环境等途径发挥抗真菌作用[11]。在NETs杀伤T.verrucosum实验中，我们用诱导的NETs与T.verrucosum共孵育。结果证实，NETs组较对照组相对真菌数量显著降低，提示NETs对T.verrucosum有明显的杀伤效应。

综上，我们的研究显示T.verrucosum可以诱导中性粒细胞产生NETs，NETs能够有效地杀灭T.verrucosum，这为深入了解中性粒细胞清除T.verrucosum感染这一病理生理过程提供了依据。T.verrucosum诱导形成NETs的具体途径与机制有待进一步实验研究。