程序性细胞死亡因子-1在过敏性疾病中的研究进展

韩 悦 姚 煦

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京，210042

程序性细胞死亡因子-1(programmed cell death 1，PD-1)是一类50～55 kD的I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族CD28/CTL-4成员，其胞浆区N端和C端各有两个酪氨酸残基，前者参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序，后者则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序[1-3]。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突细胞(DCs)以及活化的单核细胞表面[4]。研究显示PD-1在免疫反应尤其是T细胞免疫反应中具有重要作用[5]，其主要通过与程序性细胞死亡因子配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)或程序性细胞死亡因子配体2(programmed cell death ligand 2，PD-L2)结合后，形成PD-1/PD-1配体信号通路，激活蛋白酪氨酸磷酸酶，作为共刺激信号对T细胞免疫起到调节功能[6-8]。PD-L1分布广泛，表达于T细胞、B细胞、DCs、巨噬细胞、间充质干细胞培养的骨髓细胞等;PD-L2分布相对比较局限，主要表达在活化的单核-巨噬细胞和DCs[9,10]。以往大部分学者主要研究PD-1与各系统肿瘤、免疫性疾病及感染性疾病的关系[11-13]，所以先前综述集中归纳总结PD-1及其配体在肿瘤及免疫性疾病中的作用，而前者在过敏性疾病如哮喘中所扮演的角色仍没有一个明确的结论。故本文就目前PD-1信号通路在过敏相关疾病中的研究进展，以及未来在该类疾病防治中的潜在价值做一综述。

1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2

PD-1受体最初发现于T细胞表面，负责调控细胞的凋亡[14]。近几年来，不少学者揭示其在免疫耐受及各种调控作用中扮演着重要的角色。实验表明，PD-1缺陷小鼠可以引发自身免疫性疾病，说明PD-1在建立或维持免疫自稳态方面起到了关键的作用[15]。而且，在类风湿关节炎滑液和干燥综合征的唾液中T细胞表面表达的PD-1表达水平降低异常，表明PD-1可能针对靶器官发挥免疫调节功能[16，17]。

PD-1通过与T细胞表面上的配体结合来发挥免疫调节作用。PD-1配体PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)属于B7:CD28配体家族成员，是由IgC和IgV型胞外结构域组成的I型跨膜糖蛋白，由位于19号染色体上的基因编码，两者间距为22 kb[18-20]。PD-L1与CD28的配体B7.1具有20%的氨基酸同源性，而PD-L2与CTLA-4的成熟配体B7.2具有20%的氨基酸同源性[21]。在小鼠中，PD-L1和PD-L2具有70%的氨基酸同源性，而在人类中，这两种配体的同源性为40%，人类PD-L1和PD-L2的表达谱与小鼠具有很高的一致性[22，23]。PD-L1和PD-L2均含有短的胞质尾，没有已知的信号转导序列，表明两者在与PD-1相互作用时不转导信号。

PD-L1和PD-L2在不同组织中均有表达，在肺、心脏和肝脏中呈高表达，在脾、淋巴结和胸腺中呈低表达[24]。PD-L1表达于淋巴组织和非淋巴组织中，表明PD-1/PD-L1通路可以调节二级淋巴器官和靶器官的免疫反应[25]。此外，PD-L1和PD-L2在抗原提呈细胞(APC)也有表达[26]。研究显示，PD-L1表达于B细胞、T细胞、巨噬细胞和DCs表面，体外的各种刺激，包括脂多糖(LPS)、抗CD40、抗CD3、IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，均可以上调其表达水平[27，28]。与PD-L1相比，PD-L2很难在B细胞和T细胞上被诱导表达[29]。有文献报道，经IL-4、IFN-γ刺激后巨噬细胞和DCs上可以诱导出PD-L2，IL-4比IFN-γ更容易诱导PD-L2，而IFN-γ比IL-4在巨噬细胞上更容易诱导PD-L1，由于这两种细胞因子决定着Th细胞的极化方向，这表明Th1和Th2反应在激活PD-L1和PD-L2上的差异[30]。

现已证实，PD-L1在多种肿瘤中均有表达，PD-L1的表达上调与多种癌症的不良预后密切相关[31-35]。PD-L1在不同肿瘤中所扮演的角色使其成为潜在的肿瘤免疫治疗靶点。有学者发现，肿瘤相关的PD-L1在T细胞凋亡和肿瘤侵袭中发挥了重要作用，阻断PD-L1可增强T细胞免疫治疗的效果，PD-L1或PD-L2与PD-1结合抑制了T细胞的增殖和极化或改变了IL-4、IFN-γ等细胞因子的产生[36]。此外，PD-1缺陷小鼠自身免疫性疾病的引发也验证了PD-1通过诱导Th细胞向Th2方向极化，从而参与抑制信号。作者在文中强调，小鼠模型中，Th1反应与疾病进展相关，而Th2反应有助于抑制疾病的发生发展[37]。PD-L1通过抑制T效应细胞的功能及增强调节性T细胞1(Tregs1)分泌IL-10、Th3细胞分泌TGF-β来保护组织免受T效应细胞的攻击导致的免疫损伤[38]。总之，PD-1和配体PD-L1/PD-L2在维持T细胞稳态方面起着关键作用。

2 PD-1与不同细胞的作用

2.1 PD-1与树突状细胞 树突状细胞(DCs)在调节免疫应答中起着非常重要的作用，虽然通常都呈递抗原，但它们在起源、分布、细胞表面表型及功能上存在差异[39]。与T细胞结合后，DCs主导从诱导耐受到建立效应T细胞应答的免疫反应类型，DCs的作用取决于多种因素，如抗原的性质、周围组织分泌的细胞因子和表达特定的共刺激分子的DC亚群等[40，41]。实验证实，PD-L1在小鼠DCs、巨噬细胞、B细胞、T细胞上均有表达，且在活化后表达上调[42]。也有研究表明，活化的T细胞上PD-1表达升高，其配体具有不同的表达丰度，PD-L1比PD-L2的表达水平高很多[43]。相比之下，PD-L2在肺部及肺淋巴结源DCs中表达上升，并且通过α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)激活iNKT细胞后在脾DCs中上调[44，45]。肺中局部细胞因子微环境在PD-L2的表达模式中起着重要作用，且PD-L1与PD-L2可能在急性炎症过程中扮演了相反的角色。PD-1/PD-L1在DCs中具有保护作用。相对于PD-L1与PD-L2在Th1和Th2分化方面的作用，IFN-γ、IL-4在刺激PD-L1、PD-L2表达中的作用相对更大。

2.2 PD-1配体与T细胞、NKT细胞 Tregs在抑制过敏性反应中具有重要作用。Tregs减少、Th2细胞增多导致过敏性哮喘的气道高反应(AHR)和气道炎症的发展[46]。众所周知，Tregs分泌免疫抑制因子来调控免疫应答。之前有文献报道[47]，Tregs可能通过细胞表面标志物PD-1发挥抑制作用，PD-L1可以调控Tregs的生成。McGee等[48]发现PD-1在Tregs抑制AHR和气道炎症过程中发挥作用，小鼠脾、肺源Tregs表达的PD-1可以逆转肺部炎症和AHR对乙酰胆碱的作用。大部分学者认为，PD-1与Tregs的作用机制密切相关。研究表明，PD-1/PD-L1通路可以增强α-GalCer介导诱导NKT细胞的不应答[44]。Zamani等[49]揭示，细胞因子IL-2、IL-7、IL-15和IL-21直接诱导纯化的T细胞表达PD-1和PD-L1，以及诱导APC上表达PD-1配体。研究表明，PD-1/PD-L配体的表达似乎不会对T细胞扩增、功能、存活产生不良影响，但后者易受PD-1配体介导的TCR触发抑制。

尽管PD-L1和PD-L2是最重要的PD-1配体，但一些B7家族成员的其他受体也已被报道。早期研究显示，PD-L2共刺激CD4+T细胞的增殖和细胞因子的产生，而这种共刺激与PD-1无关[50]。Norde等[51]发现，PD-L1不仅与PD-1相互作用，而且与活化的T细胞上的第二受体B7-1相互作用，并且后者可以负调控T细胞的扩增。最近报道一种单克隆抗体可以阻断PD-L1与PD-1、B7-1(9G2)的相互作用，导致在α-GalCer刺激下脾脏iNKT细胞产生大量IFN-γ，但对IL-4没有任何影响。然而，选择性阻断PD-L1/B7-1(2H11)相互作用的PD-L1单克隆抗体对IFN-γ或IL-4的产生没有影响[52]。这些结果表明，PD-1/PD-L1相互作用主要是抑制iNKT细胞产生IFN-γ，TCR介导活化后PD-1在T细胞上的表达上调。

3 PD-1及其配体在各种过敏性疾病中的作用

3.1 过敏性接触性皮炎 PD-1及其配体在过敏性皮肤病中也发挥了重要的作用。接触性过敏是一种T细胞介导的迟发型超敏反应，由皮肤和黏膜表面接触过敏原引起。皮肤和黏膜过敏反应的临床表现各不相同，Hirunwidchayarat等[53]发现，黏膜较皮肤激发诱导的炎症更快速更严重，出现更多的粒细胞和CD8+T细胞浸润。然而，这些炎症反应减弱迅速，招募CD8+T细胞的CD62L-CD44low-hi记忆型细胞比例升高，IFN-γ降低、PD-1升高提示趋化的CD8+T细胞不能分化为效应性T细胞。这一发现可以解释黏膜从严重炎症中得以迅速恢复。在炎症高峰时，黏膜上皮中优先上调PD-L1的表达，而其缺失进一步加速了接触性超敏反应(CHS)，提示局部出现了PD-1/PD-L1介导的免疫调控。Dolch等[54]研究显示，IL-10在过敏性接触性皮炎的调节中扮演着特殊的角色。他们分析了小鼠CHS期间IL-10的细胞来源，并发现皮肤中表达IL-10的CD8+T细胞具有抗原特异性。即使没有CD4+细胞，IL-10缺乏小鼠也与对照组的CHS程度相当，表明CD8+T细胞衍生的IL-10对减弱CHS没有显著作用。一直以来，朗格汉斯细胞(LCs)被认为对接触性过敏原产生炎症免疫反应。有研究[55]揭示了接触过敏原对LCs中PD-L1表达以及通过改变PD-L1的表达水平来影响T细胞释放细胞因子。首先用镍激发过敏性接触性皮炎患者的单核细胞源性LCs，予皮肤切片，然后用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪分析PD-L1的表达。阻断实验显示，与未被阻断的CD86+MoLC相比，LPS刺激后的MoLC表面CD86被阻塞而导致MOLC-Th细胞共培养中IL-17的分泌水平显著减少；并且，PD-1与其配体PD-L1的结合可以调控特异性Th细胞亚群分泌促炎性细胞因子(IL-17、IL-22、TNF-α、IFN-γ等)，说明Th细胞特异性细胞因子的释放依赖于LCs的刺激和PD-L1/PD-1的相互作用。肽聚糖或LPS刺激和特异性抗体阻断PD-L1可触发CD4+T细胞中IL-17、IL-22、TNF-α和IFN-γ的释放。如果用镍作为刺激物，PD-L1的阻断会导致大量的TNF-α和IL-22产生。CCR6+/CCR4+T记忆细胞中IL-17的分泌上调，这个过程需要依赖PD-L1。结果表明，通过调控Th细胞应答，LCs上的PD-L1在IV型过敏反应中起着至关重要的作用。

3.2 过敏性哮喘 过敏性哮喘是一种与多种免疫细胞、遗传因素和环境因素有关的复杂的慢性肺病，尤其受体内肥大细胞、嗜酸粒细胞影响[56]。目前很多研究也阐明了PD-L1和PD-L2在过敏性哮喘中的作用。最近发现，PD-L2可以显著调节气道炎症和AHR，缺乏PD-L2会导致肺部炎症加重和AHR，表明肺中PD-L2可抑制气道炎症的发生和发展[57]。有学者验证了PD-L2在致敏小鼠的肺DCs和巨噬细胞中高表达，在过敏原激发期间，阻断抗PD-L2的抗体(非抗PD-1或PD-L1的抗体)可增强AHR和Th2细胞因子的产生。这一作用是由IFN-γ介导的，因为在用抗PD-L2抗体治疗的IFN-γ缺陷小鼠中没有观察到这种现象。将PD-L2-Fc加入过敏性哮喘小鼠模型中可导致血清IgE水平升高、嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润增加，PD-L2缺乏显著推进了小鼠AHR的进展[58]。有文献进一步探究了PD-L1和PD-L2在AHR中的差别：在α-GalCer的刺激下，PD-L1缺陷小鼠的AHR水平降低，气道炎症减弱，而PD-L2缺陷小鼠的AHR水平较野生型小鼠升高[59]。这些研究提示PD-L2优先调节过敏性哮喘反应的效应阶段。PD-L2的抑制作用在早期研究中已有报道，Lewkowich等[60]发现，PD-L2在小鼠模型中负性调节T细胞的活化，并且其可能在耐受过程中起着关键作用。由于PD-L1可以抑制IFN-γ的产生，因此缺乏PD-L1会导致肺中AHR水平降低，炎症和黏液分泌减少，与PD-L2在哮喘发病机制中具有相反的作用。同时在PD-L1/PD-L2双敲除小鼠中，PD-L1和PD-L2均缺失，抵消了单敲除小鼠的作用，双敲除小鼠出现了与野生型小鼠水平相当的气道高反应性。这些数据表明PD-L1和PD-L2可能在过敏性疾病的发病机制中具有相反的作用。尽管PD-L1对小鼠的AHR的发展至关重要，但激活PD-1/PD-L2通路可能引起保护性免疫反应。

3.3 过敏性鼻炎 很多人将过敏性鼻炎和慢性鼻窦炎的定义混淆，过敏性鼻炎是慢性鼻窦炎的发病原因之一，过敏性鼻炎是过敏原引起的过敏反应，只有在接触到过敏原的状态下，患者才会出现症状[61]。过敏性鼻炎的特点是鼻炎反应过敏原暴露，近期一项试验显示，过敏原激发导致体内IL-5、CCL11和CXCL8的分泌水平升高[62]。除了气道与皮肤，PD-1及其配体也参与过敏性鼻炎的发生发展。近年有文献报道[63]，PD-1的表达水平与慢性过敏性鼻炎的严重性和组织IL-5的表达水平有关，而与患者自身的过敏状态无关。作者采用PCR检测了21例慢性过敏性鼻炎患者和21名健康对照组原代上皮细胞PD-1、PD-L1、PD-L2、TGF-β、IL-5和IL-10的表达水平，采用颌面电脑断层扫描的Lund-Mackay评分评估疾病严重程度，利用流式细胞术和免疫组织化学测定PD-1和PD-L1/L2的表达。结果显示，与对照组相比，慢性过敏性鼻炎患者鼻息肉组织中的PD-1及其配体PD-L1/L2的 mRNA表达增加，PD-1的表达与总CT扫描评分相关；此外，无论是对照组还是实验组，PD-1 mRNA与IL-5存在显著正性相关。Kim等[64]研究发现，过敏性鼻炎小鼠模型中IL-5通过促进嗅觉球细胞凋亡而抑制嗅觉再生。这项研究发现过敏性鼻炎小鼠模型中高表达Caspase-3，用IL-5刺激后，Caspase-3阳性细胞数量显著增加，而Ki67表达无显著差异。此外，通过Annexin V和PI染色进一步证实了凋亡细胞的比例，并发现与其他组相比，IL-5刺激后的嗅觉球细胞的总凋亡率增加。毫无疑问，这些发现表明，嗅觉黏膜上的局部IL-5炎症可能诱导嗅觉球细胞上的凋亡途径，尽管凋亡信号途径尚未明确。

3.4 其他过敏性疾病 PD-1/PD-L1/PD-L2相互作用在其他过敏性疾病中也有报道。Fukushima等[65]发现PD-1及其配体参与小鼠过敏性结膜炎的发生，抗PD-L2单克隆抗体治疗可增强效应期嗜酸粒细胞的局部浸润，表明PD-L2与其受体(非PD-1)之间的作用对嗜酸粒细胞向结膜的募集至关重要。近年来，有学者发现角蛋白相关PD-L1在局部炎症中CD8+ T细胞的功能和外周T细胞对外源性抗原的耐受中起着关键作用[66]。

4 PD-L1与PD-L2的前景展望

随着PD-1配体的功能被逐渐揭示，PD-1/PD-L通路在T细胞活化、耐受和免疫介导的疾病中发挥着重要和多种免疫调节作用。由于PD-1在动物模型中及其与配体间的作用，人们越来越有兴趣研究PD-L并将之作为人类过敏性疾病的新治疗靶点。上调人PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体是可行的，它们与非人类灵长类基因组编码的等效分子的交叉反应为检验其在过敏性疾病发病机制的调控通路提供一个新方法。值得一提的是，通过融合蛋白或抗体PD-L1上调可能为降低过敏性疾病发病机制提供了一项有效途径。

5 总结

以往学者认为，PD-1在自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫、移植免疫中起着关键作用。近年来研究揭示PD-1及其配体PD-L1和PD-L2在过敏性疾病发病机制中的重要共刺激作用。证据表明，PD-L1参与维持耐受性并诱导过敏。此外，过敏动物模型显示，在气道高反应或皮肤黏膜炎症中，PD-L1和PD-L2在调控和极化T细胞方面具有相反的作用。随着人们对PD-1及其配体了解的深入，PD-1有望成为过敏性疾病的一种新型治疗方法。