用于构建神经变性疾病模型的3D细胞培养研究进展

陈 超 张 逸 任郭子君 张嘉禧 杨 泽 余钰琨※

阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)等神经变性疾病是目前常见的中老年人慢性疾病。这些疾病的共同病理特征是与神经细胞网络功能丧失、血脑屏障功能障碍有关，伴随突触和神经细胞减少、脑部氧化损伤和炎症反应增加[1]。其关键病理生理过程涉及中枢神经系统和周围神经系统的氧化应激、蛋白质结构异常和错误折叠等[2]。而神经元功能紊乱的主要因素为生化因素(细胞死亡、细胞微环境变化、各细胞间互相作用)和机械因素(硬度、剪切力、间隙流动)。目前，神经变性疾病的治疗颇为困难。在新药研究上，常见神经变性疾病模型受限于不能完全模拟患者体内生理状态，其药物筛选、毒理测试功能难以充分发挥，而3D细胞模型可提供复杂的微环境，更接近患者的真实环境，使细胞模型使用效率提高，因此3D神经细胞培养在未来神经变性疾病药物研发市场中可能被大规模应用。本综述将介绍常见神经变性疾病现有模型、3D细胞培养体系、体外模拟这些疾病的障碍和当前在该领域的研究进展。

1.神经变性疾病现有模型

神经变性疾病模型主要应用于药物毒理测试和有效性筛选，通常分为体内模型和体外模型[3]。

1.1 体内模型 体内模型(动物模型)分为啮齿动物模型和大型动物模型，一般以过表达的人类突变基因或者化学诱导来构建。啮齿动物模型的特征是繁殖周期较短，在不同类型的神经变性疾病中应用较广。例如AD的APPSL/PSEN1小鼠模型[4]、HD的R6/2小鼠模型[5]、多巴胺能神经毒素(1-Methy-4-pheny-1，2，3，6-tetrahydrop，MPTP)处理的PD小鼠模型[6]等。大型动物模型的特征是寿命长且与人的同源性较高，病理接近。例如，表达β-淀粉样前体蛋白的非人灵长类动物会出现认知功能轻度减退的特点[7]，表达亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)时出现脑张力障碍的表征[8]，而静脉注射MPTP会诱导这类动物出现帕金森样症状，比如黑质多巴胺能神经元减少、路易小体表达等[9]。

1.2 体外模型 体外模型常分两种：脑组织切片培养模型和2D细胞培养模型。脑组织切片培养模型又称为脑片培养，这类模型的特征是保留了大脑三维结构及神经组织生长的微环境，能广泛应用于模拟PD病理特性[10]，但培养时间不长，难以适应药物测试需求。2D细胞培养模型是目前最常用的体外模型，具有成本低、易操作的特点，常以新生的脑细胞为基础。例如，利用胎鼠或胚胎干细胞来源的多巴胺能神经元来构建PD体外模型。Sawada等[11]就利用了这种PD体外模型，研究中脑内雌激素在多巴胺神经元凋亡过程中的作用。

1.3 现有模型的缺陷 常见神经变性疾病现有模型对药物临床前研究到临床转化的过程具有重要的意义，但是这些常见神经变性疾病现有模型都存在缺陷。动物模型与患者存在明显的种间遗传差异，临床模拟程度较低，并涉及成本和伦理问题，促使人们研究低成本、高质量的细胞模型。脑片培养模型虽然保留了大脑局部的组织结构，但是脑切片实验造价较高，厚度较薄的脑切片容易缺氧坏死，利用这种模型进行药物毒理性实验易受限制[12]。2D细胞模型以单层细胞形式生长的细胞组成，而脑细胞在人类脑部以3D细胞形态存在，这种细胞模型无法近似模拟神经变性疾病患者体内细胞外基质(ECM)和细胞活动，预测细胞反应的精准度较差。相比之下，体外模型中的3D细胞培养模型近年来备受关注。以3D细胞培养技术为基础，从患者体内获取体细胞诱导为神经干细胞，培养分化成神经细胞(神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞)后，通过体外重建三维的ECM模拟脑部神经系统的微环境和神经网络结构，构建3D神经变性疾病模型，更有利于新型药物靶标的确定、高通量药物的药理检测和筛选。

2. 3D细胞培养体系

3D神经细胞培养体系是神经组织再生、中枢神经系统和外周神经系统发育的新希望，不仅能模拟人类脑部高度组织化的ECM和高度复杂化的三维神经网络，而且能反映血脑屏障功能变化和炎症反应[13]，更可构建出综合性神经变性疾病模型。3D神经细胞培养体系分成两大类：无支架系统和支架系统。无支架系统主要是通过物理方法，使细胞自发性的组装或黏附形成球状体形态，并自身分泌ECM维持3D细胞的结构[14]。支架系统主要是将细胞接种或分散于体外可见的ECM支架，自组装成三维形态的细胞，这类系统包括脱细胞支架、水凝胶支架、微流控芯片、固体多孔支架、纤维支架等，可通过生物化学、机械信号促进细胞增殖和分化。

2.1 无支架细胞培养系统 无支架系统最明显的特征是无须外界添加任何生物、化学材料，以细胞本身分泌的天然ECM为3D细胞培养支撑体系，使细胞聚集成3D球形团块[15]。利用无支架系统培养神经干细胞衍生的神经细胞主要有以下方法：悬滴培养、旋转生物反应器或轨道摇床、磁悬浮培养、超低黏附细胞培养。有研究表明，球状体细胞是构建3D神经变性疾病模型的潜在条件，他们通过旋转生物反应器或者轨道摇床的物理方法，模拟大脑皮层内神经组织结构和神经回路，突破细胞间功能交流障碍，并有效地促进营养物质和氧气在3D神经细胞培养过程中充分交换[16]。另外一些研究人员采用基于磁悬浮原理的3D细胞培养体系，培养出三维结构的神经干细胞，主要是通过丝状噬菌体、磁性氧化铁、金纳米颗粒构成的复合物，与细胞表面的IgE-Fc1RⅠ受体结合促使细胞磁化后，在外加磁场的诱导下，调节细胞悬浮程度并诱导细胞聚集成三维的神经球[17]。Zablotskii等[18]认为外施加的磁场可高效模拟细胞微环境，保持细胞黏附和活性，具有调节细胞增殖速度和定向分化的功能。

2.2 支架细胞培养系统

2.2.1 脱细胞支架：脱细胞支架以脑部组织为材料，通过机械、化学方法有效去除细胞成分，最大限度保留天然、易降解、复杂结构的ECM[19]。常用的机械手段有快速冷冻、超声、机械搅拌等。其中快速冷冻脑部组织可促进细胞内结晶体形成，结晶体破坏细胞膜导致细胞溶解，保留天然ECM支架作为神经网络形成的基础[20]。但细胞裂解后产生的碎片可能会污染沉积的ECM，故需要严格控制温度大小，以免结晶体直接破坏ECM结构。常用的化学手段有乙酸、硫酸、离子型去污剂等。去细胞处理、消化后形成含有多种生长因子的液态ECM，可通过注射方法注入细胞板形成凝胶，脑组织依赖这种天然凝胶自组装成立体结构[21]。虽然脱细胞支架培养的脑组织，在构建神经变性疾病的药物模型时免疫排斥反应相对不明显，但易受到污染和破坏，构架完整性和稳定性较差，而后面阐述的支架在构建疾病模型中较为稳定。

2.2.2 水凝胶支架：水凝胶支架采用天然材料、合成材料和复合材料搭建，通过化学方法或物理交联结合成3D神经网络结构模拟脑部ECM。这类支架的特点是高含水量、高孔隙[22]。天然材料根据性质分为生物可降解水凝胶和生物活性水凝胶。前者结构变化幅度较小，可自发性调节天然水凝胶支架结构。例如聚氨酯水凝胶构成的晶格结构在37℃下自发交联，Hsieh等[23]用其构建神经变性疾病模型。而后者需要水凝胶前体和ECM衍生信号共同模拟脑部ECM的多孔网状结构。ECM衍生信号是一种生物活性分子，可分为四大类：多糖及蛋白多糖(海藻酸、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖等)[24]、细胞黏附蛋白(明胶、玻连蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白凝集素、层粘连蛋白等)[25]、生长因子(神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等)[26]、形态发生素(骨形态发生蛋白4、视黄醇、音猬因子等)[27]。尽管天然水凝胶更接近脑部ECM(透明质酸与层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原、玻连蛋白、腱糖蛋白、蛋白聚糖等组成)[28]，但是存在免疫排斥的风险，构建神经变性疾病模型可能受到限制。

合成材料构成水凝胶支架的特征是具有一定的弹性、生物降解性[3]。如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚左旋乳酸、嵌段共聚物，可通过改变人工合成材料的分子量大小和交联密度来调节生物降解率[26]。有研究者利用多孔微结构的聚左旋乳酸合成支架，使神经干细胞免受宿主免疫排斥和坏死的侵害，促进细胞存活和分化，在多数仿生ECM支架的研究、神经变性疾病模型的构建和临床药物的研发上有积极的意义[29]。

复合水凝胶支架是天然材料和合成材料从单一性变多样性的组合性聚合物，神经干细胞可根据定向分化的细胞类型需求，在不同的水凝胶中培养[30]。例如胶原-硫酸软骨素支架、海藻酸盐-明胶支架、纤维蛋白-透明质酸支架、基质胶(MatrigelTM支架)等。这些新型复合性水凝胶可增强细胞黏附性，有利于神经干细胞增殖和分化成神经元、神经胶质细胞。有研究结果表明这类支架可模拟脑部神经前体细胞迁移路径，引导星形胶质细胞束对齐，可为构建神经变性疾病模型奠定细胞迁移基础[31]。

2.2.3 微流控芯片：微流控芯片是光刻胶(如聚二甲基硅氧烷)通过光刻等微加工技术得到的微图案结构，由单个或多个微室组成，微室之间形成微通道或微凹槽阵列[32]。微流控芯片通常以包埋细胞的水凝胶为基础，将水凝胶注射入微图案结构形成微流控平台[33]。Hughes等[34]选择MatrigelTM支架，并在凝化过程中，凝胶沿着液体流动方向对齐，引导神经突整齐排列，形成神经回路的脑类器官结构，故微流控芯片简称“芯片上的大脑”。由于水凝胶具有生物惰性，需要通过调节生化仿生梯度(细胞浓度、ECM组成浓度、细胞因子浓度)和机械信号(弹性模量、基质硬度梯度)，额外添加被整合素受体识别的ECM衍生蛋白或短肽(RGD序列、IKVAV序列、YIGSR序列)[35～37]，以促进神经干细胞和神经细胞的长期存活，有利于检测不同细胞类型的细胞间交流功能和相互作用，可利用多电极、钙成像、光刺激等技术监测微流控平台中的神经活动。最新研究发现，微流控芯片也可在无支架系统中实现神经球的培养，利用悬滴技术和微流控平台共同制作的芯片[38]，为研究神经变性疾病提供新的方向，更有利于有效构建神经变性疾病模型，可用于高通量筛选新型药物或研究神经发育过程。

2.2.4 固体多孔支架：虽然水凝胶支架和微流控芯片均提供了良好的脑部ECM微环境，但培养效率较低，而固体多孔支架融合了生物材料、生物活性分子和细胞，具有高孔隙率、高机械稳定性[39]，实现了一步到位的自组装系统，有利于营养物质转运和气体交换，孔隙本身也可限制菌落大小，降低细胞死亡率。用于制作固体多孔支架的技术手段包括盐浸、冷冻干燥、相分离、气体发泡、3D打印等。3D打印是目前固体多孔支架中最常用的技术方法，可沉淀包含生物材料和细胞的生物墨水。3D打印将细分成光固化和基于挤出、液滴、激光等技术的打印，有利于更精确控制拓扑特性(孔径、孔形、孔隙率)。Gu等[40]将琼脂糖、羧甲基壳聚糖、藻酸盐共同组成的生物墨水与神经干细胞结合后，可打印出多孔网格结构，并证明这类技术制作的固体多孔支架可支持神经干细胞的增殖和分化。

2.2.5 纤维支架：纤维支架是水凝胶支架的延伸，通常利用水凝胶支架中的天然、合成材料，通过相分离、自组装、静电纺丝等技术合成纤维支架[41]。静电纺丝技术制作的纤维支架常用于3D神经细胞培养，例如电纺聚乳酸纤维支架、电纺明胶纤维支架、电纺聚己内酯纤维支架等可作为3D培养神经干细胞、诱导神经干细胞分化成神经细胞的基础。

构建体外模型的过程中，患者来源的神经干细胞可通过上述基于水凝胶材料的水凝胶支架、微流控芯片、固体多孔支架和纤维支架，形成类似于脑部神经细胞类型、结构和功能的三维聚集体，简称“脑类器官”[42]。与无支架系统中形成的球状体相比，脑类器官依赖水凝胶材料提供的ECM微环境，模拟中枢神经系统和周围神经系统的复杂组织结构，对神经干细胞的增殖、迁移、分化起着重要调节作用。在构建神经变性疾病模型过程中，3D神经细胞培养体系可高效体外模拟AD、PD、HD等疾病的障碍，该领域的最新研究成为药物高通量筛选和毒理测试的潜在基础[43]。

3 体外构建神经变性疾病的3D神经细胞模型

神经变性疾病是由基因突变、多因素遗传、环境风险等因素引起[44]。新药研究的关键是要寻找精准度高的疾病模型，从而为高通量筛选、药理毒理测试奠定基础[28]。

3.1 阿尔兹海默症3D神经细胞模型 AD是最为普遍的痴呆类神经变性疾病，患者常表现出记忆、语言、理解能力渐进性丧失，直至后期完全性认知障碍而死亡[45]。至今为止仍未有药物能有效阻止疾病的发生，仅有少数上市药物可缓解早期患者的短期症状。大多数患者患有散发性AD(SAD)。SAD与罕见的早发、家族性AD(FAD)的致病因素不同。SAD涉及了多因素遗传和环境风险因素，而FAD主要是由(APP、PSEN1、PSEN2)基因突变所引起，简称F突变[3]。

早期阶段FAD的病理标志体现在神经元减少，涉及内质网应激水平升高、线粒体功能障碍、氧化应激和糖基化改变、致病性β-淀粉样蛋白(Aβ)过度蓄积、高度磷酸化的微管相关蛋白(p-tau)沉积等病变过程[46]。FAD关键病理标志是Aβ斑块和神经原纤维缠结的形成(NFTs)。尽管单个或多个F突变的转基因小鼠模型重现了Aβ斑块及Aβ蛋白诱导的突触缺失，2D细胞模型也出现了Aβ蛋白增长的趋势[46]，但它们均缺乏p-tau驱动的NFTs、高水平的致病Aβ蛋白、成熟老化的神经元等关键病理标志。主要原因是动物模型内源性的tau蛋白抑制了患者外源性tau蛋白的聚集和磷酸化，例如PDAPP小鼠[47]。而在2D细胞模型中，因为需要定期更换培养液，Aβ蛋白无法聚集，且由于Aβ42水平过低，无法形成Aβ斑块及AD致病级联反应出现的NFTs。3D神经细胞培养体系提供相对封闭的微环境，可引发Aβ蛋白聚集和包括NFTs在内的AD致病级联反应。例如选择MatrigelTM支架提供脑样环境，患者来源的F突变神经细胞通过Aβ染料Amylo-Glo和Aβ免疫染色方法，可观察到细胞外存在Aβ蛋白沉积现象，而利用β/γ-分泌酶抑制剂，可减少Aβ蛋白并减弱磷酸化的p-tau蛋白，可观察3D细胞模型重演Aβ蛋白和NFTs涉及的病理过程[46]。另有报道利用F突变、神经干细胞来源的小胶质细胞，通过微流控芯片体外构建AD模型，其中小胶质细胞被Aβ蛋白激活产生一系列的促炎分子(IL-1、IL-6和TNF-α)，影响神经元损伤和Aβ蛋白沉积[48]。针对AD疾病模型，将2D培养的神经前体细胞移植到包含Aβ蛋白溶液的微流控芯片内，发现细胞在芯片内部凹形微孔结构中自我聚集，形成神经球并短时间内分化完全[49]。

虽然目前中老年人患病趋势更多地被划分为SAD，但是由于SAD致病因素可控性差，相比FAD，SAD疾病模型严重缺乏。曾有研究者从SAD患者中抽取体细胞，基于3D细胞培养体系使其诱导分化成神经球，检测到仅有少数神经元显示Aβ水平较高，且β/γ-分泌酶抑制剂无明显降低Aβ斑块的作用[50]。3D细胞模型可能无法模拟SAD发病病理，构建SAD神经细胞模型仍需进一步的研究和探讨。

图1 3D培养神经干细胞源性的神经细胞在神经变性模型中的应用

3.2 帕金森病3D神经细胞模型 全球第二大的神经变性疾病是运动障碍类的PD。PD患者典型症状表现为失控性震颤、强直、运动迟缓、身体重心失衡[51]。该疾病与上述AD疾病类似，可细分为家族性PD和散发性PD，而大多数患者属于散发性PD，主要致病因素是与路易小体中的ɑ-突触核蛋白(ɑ-syn)错误折叠有关[52]。在遗传因素和环境因素的影响下，天然ɑ-syn错误折叠、转化成低聚物和纤维，最终异常聚集、沉积形成路易小体，是散发性PD独特病理特征。患者占少数的家族性PD与ɑ-syn基因组成SNCA的点突变有关[53]。PD的病理学特征包括线粒体功能障碍、炎症反应、路易小体形成、中脑黑质致密部内多巴胺能神经元(mDA)缺失等，但mDA丢失的确切病理机制还未清楚。目前非灵长类动物(如猫、绵羊、猪)和灵长类动物模型还不能反馈mDA缺失的帕金森样状态。国内研究小组曾利用CRISPR/Cas9技术，产生具有三基因(parkin/DJ-1/PINK1)突变的猪PD模型，但是后期临床实验并不符合模型预期[54]。

利用3D细胞培养技术构建的PD模型，主要模拟散发性PD病理特征。有研究者利用3D培养体系形成高度组织化的ECM空间，从神经干细胞中培养分化获得mDA、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并有突触连接和自发性神经活动。3D培养神经干细胞源性的神经细胞，可切实反映脑部神经组织结构和功能，有可能模拟PD功能障碍。例如Freundt等[55]利用微流控芯片的结构优势，在凹陷槽孔中置入包含ɑ-syn的纤维材料，将PD患者来源的神经细胞整合到微流控体系中。3D培养的神经元移动方向具有相对齐性。在原有微流控芯片基础上，添加微阀控制芯片上凹槽的液体流速，可使PD模型更加贴近疾病病理特征[13]。

3.3 亨廷顿舞蹈病3D神经细胞模型 HD是不可治愈的遗传性神经变性疾病。HD患者的典型特征是肢体不自主运动、人格变化、认知功能障碍甚至丧失[56]，主要病因是HTT基因中CAG重复，导致毒性HTT扩增、纹状体中等棘状神经元丢失，影响大脑周围区域发生不可逆转的变化。与AD类似，市场上HD的药物只能缓解早期症状。在药物临床检测过程中，R6/2模型是常用的小鼠HD模型，包含了120个CAG重复序列的突变体，表型上也重现了HD的典型特征[57]。而构建更为经济的3D神经干细胞来源的HD模型的主要难点在于高度复杂化纹状体神经环路的重新构建[43]。

在3D神经细胞培养体系中，所利用的生物材料可增强纹状体神经干细胞的快速分化[58]，通过机械、化学信号构建的ECM微环境，可影响纹状体神经干细胞分化的细胞类型、黏附程度和增殖速度。有研究显示，弹性模量较大的支架有利于分化成纹状体神经胶质细胞，而弹性模量较小的支架有利于分化成纹状体神经元[59]。例如Tang-Schomer等[60]通过控制不同机械硬度的支架与丝蛋白水凝胶材料共同构建类器官样的HD模型可获得分化不同的细胞。目前利用3D细胞培养技术构建HD模型的案例较少，但是未来HD模型的发展更趋向于利用3D细胞培养体系构建HD模型，该模型更有利于研究纹状体神经元及其神经胶质细胞之间的相互作用、准确模拟HD疾病的生理学、病理学特征。

4. 3D神经细胞培养用于体外模型的局限和展望

3D神经细胞培养体系高效、利于快速检测和筛选新型药物，是疾病模型和药物临床前实验的重要工具[43]。尽管3D神经变性疾病模型有可能成功模拟疾病的病理发展过程，但是3D细胞模型缺乏血管化是三维神经组织培养的最大挑战。血管在气体交换、营养物质运输、废物清除中起着关键作用[45]，仅有少数微流控芯片系统能初步模拟血流的介质灌注流和组织血管化过程[13,61]。在培养较大的球状体或类器官过程中，无法长期培养疾病模型从而限制药物筛选应用。此外，3D培养的细胞缺乏老化现象[62]，不利于构建晚期患者的疾病模型，无法进行药物功能性测试，而AD、PD、HD等神经变性疾病患者常是晚期发病，故3D神经细胞培养体系所构建的体外模型更多的被应用于疾病早期药物的筛选、检测，晚期药物实验需动物模型支持。

3D培养神经干细胞源性的神经细胞可通过多种方法制备(如图1)。构建神经变性疾病模型的3D细胞培养应该考虑三个方面：一是共培养各种细胞类型同时，模拟大脑神经组织网络和血管网络；二是外加动态的机械性能，例如设置梯度浓度引起液体流动；三是模拟复杂的大脑生理动态微环境，促进神经元与星形胶质细胞相互作用和跨越神经血管单元的功能障碍维护血脑屏障系统，更有利于该模型的模拟人类生理学和病理学，增加对疾病机理的理解。