五味子总多糖及总木脂素对小鼠急性肝损伤作用的比较研究

王 瑶 刘春娜 张羽翀 苑丽葳 李 贺 孙靖辉 王春梅 陈建光

肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，因此，肝损伤会导致各种肝病的发生和发展，甚至会诱发肝硬化和肝癌[1]。因此，寻找修复肝损伤的药物及保健食品是人们一直以来的研究热点。五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实[2]，被《神农本草经》列为上品。现代研究证实五味子的主要活性成分有多糖(SCP)和木脂素(SCL)[3,4]。依据文献报道及本研究的前期工作发现，SCP及SCL均对实验动物肝损伤具有显著的保护作用[5～7]，但在相同剂量下，或两者分别半量合用在同一肝损伤模型上的作用比较尚未见报道。因此，本研究采用酒精肝损伤和对乙酰氨基酚(APAP)肝损伤两种模型对SCP及SCL进行比较研究，以期为五味子有效成分在产品开发中的选择利用提供理论依据。

1.材料

1.1 动物 清洁级健康ICR小鼠，雄性，体质量(20±2)g，由长春亿斯实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)-2018-0007。小鼠分笼饲养，饲料充足，饮水不限，室温20～25℃，适应环境3天后用于实验。

1.2 药物与试剂 APAP(上海阿拉丁试剂有限公司，批号:103-90-2，纯度：99%)；SCP及SCL(吉林省五味子开发与产业化工程研究中心)；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 仪器 Infinite M200TECAN 酶标仪(瑞士TECAN集团公司)；JY92-IID超声波细胞粉碎仪/粉碎机(宁波新生生物科技股份有限公司)；ESJ110-4B电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)。

2.方法

2.1 实验动物分组、给药及模型制作

2.1.1 酒精肝损伤模型：50只ICR小鼠随机分为5组，分别为空白对照组(CON)、酒精模型组(MOD)、SCP组、SCL组、SCP+SCL组。常规饲料喂养，自由饮水。适应性饲养3天后，SCP组、SCL组及SCP+SCL组分别给予SCP 100mg/kg，SCL 100mg/kg以及SCP 50mg/kg+SCL50mg/kg，10ml/kg灌胃给药。CON和MOD组均灌胃给予同体积蒸馏水，每日1次，连续14天。末次给药1小时后，MOD及给药组小鼠给予50%乙醇10ml/kg一次性灌胃，CON组小鼠给予同体积蒸馏水，禁食，不禁水。16小时后，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，处死。

2.1.2 APAP肝损伤模型：50只ICR小鼠随机分为5组，与酒精肝损伤模型相同的分组及给药。但在末次给药禁食(不禁水)1小时后，除对照组外，每组小鼠腹腔注射250mg/kgAPAP生理盐水溶液(10ml/kg)；对照组给予相同体积生理盐水腹腔注射。APAP腹腔注射12小时后，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，处死。

2.2 小鼠肝脏指数计算 实验结束时称量小鼠体质量，眼眶取血，断头处死小鼠，取出肝脏并称重，计算肝脏指数(肝重/体重×100)。

2.3 小鼠血清ALT和AST水平检测 各组小鼠眼眶后静脉丛取血，室温静置30分钟后，血液凝固，3500r/min离心10分钟，取上清，-80℃保存备用。按照ALT和AST测量试剂盒说明书操作，酶标仪于不同波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算样品ALT和AST浓度。

2.4 统计学方法 实验数据用Graph Pad Prism 6软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。数据以均数±标准差表示，P<0.05为具有统计学显著差异。

3.结果

3.1 SCP及SCL对肝损伤模型小鼠肝脏指数的影响 对酒精性肝损伤小鼠肝脏指数检测结果显示，与CON比较，酒精MOD小鼠肝脏指数显著增大(P<0.01)。而与MOD比较，SCP组、SCL组、SCP+SCL组小鼠肝脏指数显著降低(P<0.01)。而SCP组、SCL组及SCP+SCL各组间小鼠肝脏指数未见统计学差异(P>0.05)。结果见图1。

注：与空白组(CON)相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与模型组(MOD)比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。图1 SCP及SCL对酒精诱导的小鼠肝损伤肝脏指数的影响

对APAP致肝损伤小鼠肝脏指数检测结果显示，与CON比较，APAPMOD小鼠肝脏指数显著增大(P<0.01)。与MOD比较，SCP组、SCL组及SCP+SCL组小鼠肝脏指数显著降低(P<0.01)。而SCP组、SCL组及SCP+SCL各组间小鼠肝脏指数未见统计学差异(P>0.05)。结果见图2。

注：与空白组(CON)相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与模型组(MOD)比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。图2 SCP及SCL对APAP诱导的小鼠肝损伤肝脏指数影响

3.2 SCP及SCL对小鼠血清ALT及AST水平的影响 对酒精性肝损伤小鼠ALT及AST水平的检测结果如图3显示，与CON相比，在经过酒精处理后，MOD小鼠血清ALT和AST水平显著升高(P<0.01)。与MOD相比，SCP组、SCL组及 SCP+SCL组均可显著提高ALT和AST水平(P<0.01或P<0.05)，而SCP组、SCL组及SCP+SCL各组间ALT和AST水平未见统计学差异(P>0.05)。

注：与空白组(CON)相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与模型组(MOD)比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与SCP组比较，△表示差异显著(P<0.05)，△△表示差异极显著(P<0.01)。图3 SCP及SCL对酒精诱导的小鼠肝损伤ALT和AST水平的影响

如图4所示，与CON相比，在经APAP处理后，MOD小鼠血清ALT和AST水平显著升高(P<0.01)。与MOD相比，SCP组、SCL组及SCL+SCP组小鼠血清ALT和AST水平均显著下降(P<0.01)。而在此基础上，SCP组小鼠血清中ALT和AST水平比SCL组和SCP+SCL组更为降低(P<0.05，P<0.01)。

注：与空白组(CON)相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与模型组(MOD)比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与SCP组比较，△表示差异显著(P<0.05)，△△表示差异极显著(P<0.01)。图4 SCP及SCL对APAP诱导的小鼠肝损伤ALT和AST水平的影响

4.讨论

五味子是吉林省长白山特色药材，其应用广泛，已有几千年的历史，是药物和保健食品开发的理想资源。现代药理学研究表明，其主要成分五味子多糖及木脂素均对多种肝损伤具有保护作用[8,9]。本研究应用经典的酒精及APAP所致急性肝损伤小鼠动物模型及三个特异性的指标，进一步明确五味子多糖及木脂素对肝损伤的保护作用，并对相同剂量五味子多糖及木脂素以及半量合用进行了功效比较。

研究表明，肝脏指数是体现肝脏损伤程度极其重要的指标[10,11]。本研究结果显示，在酒精和APAP两种小鼠肝损伤模型中，MOD小鼠的肝脏指数均显著升高，这与其他相关报道是一致的[6～8]。SCP、SCL及SCP+SCL均使各组小鼠肝脏指数显著下降，且组间无差异，提示SCP及SCL均能够抑制酒精及APAP诱导的肝脏增大，且SCP与SCL对两种小鼠肝损伤模型的肝脏指数的影响没有显著区别。

ALT和AST是肝细胞内主要功能酶，当肝细胞受损后，其血液中的含量会随之提高，数值的变化是肝细胞损害的敏感性指标，其高低可以表明肝脏的受损程度，因此，对评价肝脏功能状态及损伤程度有着十分重要的意义[12～15]。本研究结果显示，在酒精和APAP两种急性肝损伤模型中，MOD小鼠血清中的ALT和AST水平均显著升高，而SCP、SCL及 SCP+SCL可使ALT和AST水平显著降低，提示两者均能够改善酒精及APAP所致的肝脏损伤。在APAP肝损伤模型试验中，SCP组小鼠ALT和AST的水平较SCL以及SCP+SCL组均显著降低，而在酒精性肝损伤模型试验中各给药组间无显著统计学差异，提示SCP在不同的肝损伤模型中其作用强度不同。

研究表明，用乙醇诱导小鼠酒精性肝损伤具有成模稳定、死亡率低、周期短以及类似人类饮酒等特点[16,17]，是很好的经典肝损伤造模药物。乙醇主要在肝脏代谢，被氧化为乙醛后与胞质内乙醇脱氢酶作用并产生大量H+，导致氧化应激反应异常；另有少部分经肝细胞微粒系统催化产生大量自由基，导致肝细胞损害。同时，乙醇可使肠道的通透性增加，使内毒素轻而易举地就能从肠道进入门静脉系统，从而诱导内毒素血症，刺激库普费细胞(kuffer cells)产生大量细胞因子，导致肝脏炎性损伤[18,19]。APAP也是常用的诱导急性肝损伤的工具药物[20,21]。APAP在肝内的主要代谢产物是葡萄糖醛酸和硫酸盐偶联物，少量被CYP2E1转化为一种具有高度活性的毒性代谢产物N-乙酰-对-苯醌亚胺(NAPQI)[22,23]。正常情况下，NAPQI由于肝中GSH的减少而被迅速激活，然后在胆汁和尿液中排泄为半胱氨酸和巯基酸。当大量服用APAP时，葡醛内酯和硫酸盐途径发生饱和，过量的APAP在CYP系统的代谢下产生大量的NAPQI，消耗肝中GSH，未与GSH共价结合的NAPQI还可以与细胞蛋白硫醇共价结合，降低肝的抗氧化能力，导致氧化应激，最终诱发肝细胞损伤[24,25]。由此可见，乙醇和APAP所引起的急性肝损伤模型均与氧化应激异常有关。

本研究前期工作发现，SCP和SCL及其体成分均具有抗氧化能力，通过调节Nrf2-NO-1抗氧化通路，增加血清及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽S-转移酶以及血红素氧合酶-1含量，降低MDA水平[26～28]。此外，SCP能够参与CYP系统的代谢调节作用[29]，而SCL却未见相关作用报道。由此，我们推测SCP在APAP肝脏损伤模型的保护作用优于SCL，可能与其参与CYP系统的代谢调节以及抗氧化能力的不同有关，具体机制尚需进一步研究。

综上所述，SCP与SCL在酒精和APAP急性肝损伤模型中都显示出显著的肝损伤保护作用，而SCP在APAP模型中显示出较强的降低ALT、AST作用。