超声微泡靶向递送MaFGF改善糖尿病心肌病大鼠左心室收缩功能的初步实验研究

迟婷婷 滕银燕 孙玮明 林海霞 郑磊 田新桥

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作为糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者严重且常见的并发症之一，伴随DM患者数量的增长而迅速增多，已成为DM患者发生心力衰竭的重要原因。因此，DCM的防治研究成为近些年医学领域亟待解决的问题。有学者基于酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）特点[1-2]，构建了aFGF的突变体，即改构型酸性成纤维细胞生长因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF），经实验证实MaFGF在改善心功能障碍方面极具前景[3-4]，但因其稳定性差[5-6]，易失活，且目前缺乏高效的靶器官速递技术，使药效得不到充分发挥，限制其临床应用与开发。超声靶向微泡击破技术（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD） 恰是超声医学领域新兴靶向传输技术，是利用超声波空化效应与声孔效应增加血管内皮通透性，增加外源性物质到达靶位的数量，从而发挥更强生物学作用，在心血管疾病防治方面发挥越来越大的价值[7-9]。因此，本研究拟应用UTMD技术将MaFGF靶向递送到DCM大鼠的左心室，再应用超声心动图、速度向量成像（velocity vector imaging，VVI）及病理学检查等多种方法评价其对DCM大鼠左心室收缩功能的改善价值。旨在为DCM的防治研究提供更多的实验数据与方法，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠75只，鼠龄 40～50d，体重（210±25）g，由温州医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（浙）2019-0001]；MaFGF冻干粉由温州医科大学生物与天然药物开发中心有限公司提供；微泡对比剂采用SonoVue（Bracco公司，产品批号：18A022A）。实验采用Acuson Sequoia 512C彩色多普勒超声诊断仪（Siemens公司），线阵探头（15L8w-S），频率12 ～14 MHz。TUNEL试剂盒购自罗氏公司（批号：11684817910），链脲佐菌素（STZ，批号：WXBC6558V）、天狼星红染色试剂（批号：29384K）购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 制备MaFGF的超声微泡混悬液 50μg MaFGF冻干粉与5ml 0.5%氯化钠溶液混合，轻度振摇充分溶解后形成单纯MaFGF溶液。再将5 ml单纯MaFGF溶液注入SonoVue瓶中，形成MaFGF-SonoVue混悬液，临用前持续振荡摇匀。结合既往研究使用的MaFGFSonoVue混悬液中含MaFGF的浓度为10μg/ml[3]。

1.2.2 动物模型建立、分组和干预 75只大鼠在通风恒温的SPF级动物房内适应性饲养1周（室温约20～24℃，平均湿度约50%～60%，人工控制开关模拟昼夜变化，饲养过程中无菌水自由供给），禁食不禁水12h。采用随机数字表法挑选15只作为N组，不做干预，余60只经腹腔一次性注射70mg/kg的STZ（使用前用pH为4.5的柠檬酸缓冲液稀释为1%溶液）诱导建立DM模型，分别于注射后第1天、第3天、第7天尾静脉取血测空腹血糖浓度，血糖浓度持续稳定在16.7mmol/L以上，且出现多饮、多食、多尿现象后，继续高糖、高脂饮食饲养8周，研究发现DM大鼠8周后就出现心功能异常，即认为形成DCM模型[10]。将造模成功52只大鼠（剔除8只造模未成功）采用随机数字表法分为4组，分别为DCM 组 、MaFGF 组 、MaFGF-SonoVue 组 、MaFGFSonoVue+UTMD组，每组13只。

N组及DCM组不做干预处理，MaFGF组及MaFGFSonoVue组大鼠由10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3ml/kg）后分别经尾静脉一次性缓慢推注MaFGF溶液及（MaFGF-SonoVue）混悬液，1min内完成注射。MaFGFSonoVue+UTMD组大鼠麻醉后，剃掉心前区鼠毛，将超声仪探头置于心前区皮肤，取乳头肌水平左室短轴切面，聚焦深度为 3.5～4.0 cm，经尾静脉一次性缓慢推注MaFGF-SonoVue混悬液，1min内完成，当心肌内见大量微泡充盈时即用机器自带的MBD功能反复多次爆破微泡（机械指数MI=1.9），直至微泡完全消失。实验大鼠给药剂量为15μg/kg。每周干预2次，连续4周。

1.2.3 图像及数据采集 干预4周后，所有大鼠逐个称重、记录数据，麻醉后连接心电图，行常规超声心动图检查，测量各组大鼠的左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室射血分数（LVEF）及左心室短轴缩短率（LVFS）。随后启动VVI成像模式，于乳头肌水平左心室短轴观采集连续3个心动周期的二维灰阶动态图像，存入MO光盘，然后导入Siemens Sygno US Workplace 3.01分析软件进行分析，测定左心室6个室壁节段的收缩期平均峰值速度（Vs）、径向应变（Sr）及径向应变率（SRr）。

1.2.4 心肌细胞凋亡指数（AI）检测 处死大鼠，打开心包，剔出左心室，取乳头肌水平左心室心肌，置于10%的甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋，连续约5μm切片，按照试剂盒指示进行TUNEL染色，光学显微镜下进行观察。每组取12张切片，每张切片随机取20个400倍视野，计数该视野细胞中染色阳性的细胞数，AI（%）=视野内的阳性细胞数/视野内总的细胞数×100%。

1.2.5 血管周围胶原面积与血管腔面积之比（PVCA/LA）检测 取每组大鼠心肌组织切片，按照试剂盒说明书进行天狼星红染色。封片后置于光学显微镜下观察，随后应用IPP6.0软件分析计算PVCA/LA，每组取12张切片，每张切片随机取20个400倍视野。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。数据进行正态性检验，计量资料以表示，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。方差齐性者两两比较采用LSD-t检验；方差不齐者采用Dunnett's T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 实验结束，N组无死亡，DCM组死亡4只，MaFGF组及MaFGF-SonoVue组各死亡3只，MaFGF-SonoVue+UTMD组死亡2只。

2.2 各组大鼠常规超声心动图及VVI指标比较 见表1。

表1 超声心动图比较及VVI指标比较

由表1可见，干预4周后，DCM组LVIDd及LVIDs均较 N 组增加（均 P＜0.05），而 LVEF、LVFS、Vs、Sr及SRr却明显下降（均 P＜0.05）；MaFGF 组和 MaFGFSonoVue 组 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr较 DCM 组上升（均 P＜0.05），LVIDs 却减低（均 P＜0.05），但两组间无明显差异；MaFGF-SonoVue+UTMD组LVIDd及LVIDs均较 DCM 组降低（均 P＜0.05），且 LVEF、LVFS、Vs、Sr、SRr较MaFGF组及MaFGF-SonoVue组均明显升高（均 P＜0.05）。

2.3 病理学检查结果 TUNEL染色示凋亡细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈蓝色，干预4周后，N组心肌仅有极少数细胞发生凋亡（插页图1a）；DCM组细胞凋亡增多（插页图1b）；MaFGF组及MaFGF-SonoVue组凋亡细胞数目相近，但较DCM组减少（插页图1c、d）。MaFGFSonoVue+UTMD组凋亡细胞数较其他治疗组减少（插页图 1e）。

天狼星红染色显示DCM组血管周围纤维化情况较N组明显增多（插页图2a、b），MaFGF组及 MaFGFSonoVue组均较DCM组略好转（插页图2c、d）；MaFGFSonoVue+UTMD组较其他治疗组好转（插页图2e）。

2.4 各组大鼠AI及PVCA/LA比较 见表2。

表2 各组大鼠AI及PVCA/LA比较

由表2可见，DCM组AI及PVCA/LA均较N组明显升高（均 P＜0.05）；MaFGF 组及 MaFGF-SonoVue组间AI及PVCA/LA均无统计学差异，但较DCM组均略下降 （均 P＜0.05）；MaFGF-SonoVue+UTMD 组 AI及PVCA/LA较其他治疗组均明显下降（均P＜0.05）。

3 讨论

DCM的概念是Hamby于1974年首次提出[11]，是指独立于DM基础心肌组织发生结构与功能的损伤，逐渐进展将导致充血性心力衰竭、心律失常及心源性休克，已成为DM患者死亡的重要原因之一。目前DCM确切发病机制尚不明确，但普遍认可针对抗氧化应激损伤、诱导心肌血管生成、改善心肌微循环状态、抗心肌细胞凋亡及纤维化治疗等是DCM防治的重要策略[12]。因此具有抗氧化损伤、扩张血管、营养神经及保护心脏等功能的aFGF成为具有治疗DCM潜力的药物，但aFGF同时兼具诱发肿瘤风险，限制其应用，于是我们使用具有aFGF同等心脏保护作用的突变体，即MaFGF。研究发现，在冠心病大鼠模型心肌组织中注射MaFGF可显著减少心肌细胞凋亡并改善心功能[5]，另有研究表明MaFGF可能通过抗氧化应激来抑制DM诱导的心功能障碍[6]。然而MaFGF是一种稳定性较差的生物大分子药物，在体外极易失活，全身给药不良反应大，目前缺乏安全、速效、可控的靶向给药手段，以至MaFGF无法得到开发与推广。

UTMD恰是超声医学领域发展较快的靶向递药技术，具有靶向性强、侵袭性低、免疫原性低、毒性低、组织特异性及可重复性等优点[13]。田新桥等[14]利用UTMD递送aFGF有效改善DCM大鼠的左心室收缩功能。张明等[15-16]利用UTMD技术将分别包载bFGF、aFGF的纳米粒靶向递送到DM诱导的心肌组织中，结果明显延缓DCM进程，改善心脏功能，减轻心肌细胞纤维化和凋亡现象，提升心肌组织微血管密度。可见UTMD技术为MaFGF靶向治疗DCM实验研究提供了一种全新的方法。

我们利用UTMD技术将MaFGF送达DCM大鼠心肌组织后及时爆破，观察该靶向给药系统下DCM大鼠的左心室收缩功能变化。实验末，应用常规超声及VVI检测发现：DCM组LVIDd及LVIDs均较N组增加，而LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr明显减低，说明 DCM 大鼠左心室功能明显受损；经TUNEL染色及天狼星红染色后显示：AI及PVCA/LA较N组明显增高，说明DCM组大鼠出现明显细胞凋亡及血管周围纤维化现象。而经过MaFGF及MaFGF-SonoVue治疗后较DCM组 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr增高，LVIDs、AI及 PVCA/LA 降低，说明大鼠左心室收缩功能、细胞凋亡及间质纤维化现象得到改善，但两种方法疗效没有差异性。MaFGFSonoVue+UTMD 组大鼠 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr较其他治疗组明显增高，说明UTMD技术可提高药物对左心室收缩功能疗效，AI及PVCA/LA明显降低，可见MaFGF保护心肌的机制可能是从抗细胞凋亡、抗间质纤维化方面发挥作用。总之，UTMD靶向递药系统为DCM防治提供了一种全新的靶向输药手段，在临床应用上极具前景，MaFGF有望成为治疗DCM的研究方向。

本研究尚存在一些不足，治疗组之间LVIDd无明显改善，可能是因为给药时间短或者样本数量较小，超声微泡作为药物或者基因的载体，载药量较低，稳定性较差，局部维持时间较短，有待进一步优化。