Egr1 影响瘢痕疙瘩发病机制的研究进展

2020-01-09聂文婷秦海燕张连波

中国实验诊断学 2020年1期

聂文婷，秦海燕，张连波

(吉林大学中日联谊医院整形外科，吉林长春130033)

瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维性良性肿瘤，主要表现为成纤维细胞过度增殖和细胞外基质(ECM)过量沉积[1]，是皮肤损伤和刺激后伤口异常愈合的结果[2，3]。在发达国家，每年约1亿人不同程度受瘢痕的困扰[4]。在所有种族的个体中均可见瘢痕疙瘩的形成，但白化病患者中未见发病。根据瘢痕疙瘩的数量，大小和位置不同，其可不同程度影响患者的生活质量，身体状况和心理健康，如患者局部美观改变、主观感受异常(瘙痒、疼痛等)及瘢痕挛缩所导致的功能性障碍等[5]。瘢痕疙瘩组织学特征包括成纤维细胞的增生和ECM尤其是胶原蛋白的过度沉积和无序排列[3]。目前现有的预防和治疗策略主要包括压力治疗、硅凝胶片治疗、冷冻治疗、放射治疗、激光治疗、药物治疗(曲安奈德、干扰素、5-氟尿嘧啶等)和手术切除[6]。由于瘢痕疙瘩的具体发病机制目前尚不完全明确，尽管以上治疗方法目前可暂缓其发病进程，但临床仍缺乏有效的根治性手段。瘢痕疙瘩其高复发率对整形外科医生来说仍是一个巨大的挑战[6,7]。

早期生长反应因子1(Egr1)也称为Zif268，NGFI-A，Krox 24或TIS8,被定义为59kDa的锌指转录因子。作为一种重要的转录因子，Egr1已被揭示在多种途径中发挥重要作用，其表达与多种人类疾病进程相关，包括癌症、炎症、动脉粥样硬化和一些纤维化疾病[1,8]。 Egr1通过调节多种下游基因的转录，从而影响炎症、基质形成、血栓形成、细胞凋亡和重塑。其突出的下游基因靶点包括成纤维细胞生长因子2、CD44、纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)、纤溶酶原激活物抑制剂-1、尿纤溶酶原激活物(uPA)、p53 、肿瘤坏死因子(TNF)等[6,9]。Egr1也是在纤维化中高度表达的一类促纤维化基因[1]，其作用包括激活生长和分化相关靶基因的转录；但当Egr1过表达时则起到抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，敲除Egr1基因时可促进细胞增殖[10]。我们从ArrayExpress数据库下载源自瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的微阵列数据，通过功能和途径分析研究瘢痕疙瘩和增生性瘢痕样本中常见的差异表达基因(DEG)推测出Egr1是皮肤瘢痕形成的重要调控因子[11]。本文通过对创口愈合和瘢痕疙瘩形成机制多个方面的阐述，对Egr1可能参与瘢痕疙瘩形成的机制做一综述。

1 创伤愈合概述

瘢痕疙瘩是由于伤口愈合异常引起的纤维增生性疾病，定义为某些伤口愈合过程的调节增加或减少。因此，为了明确瘢痕疙瘩的发病机制，了解创伤愈合的基本过程是必不可少的。

伤口形成后，通过血小板脱颗粒，补体激活和凝血级联反应，形成用于止血的纤维蛋白凝块，也可用作伤口修复的支架[6]。血小板脱颗粒负责释放和激活一系列强效细胞因子，如表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β(TGF-β)，作为用于募集中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞的趋化剂[5,6]。与来自正常组织的成纤维细胞相比，源自瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞表现为以上生长因子受体及受体反应性的增加。在创口形成后48至72小时内，愈合过程由炎症期过渡为增殖期，增殖期可持续3至6周[5]。此时募集的成纤维细胞合成修复组织的支架，即ECM。ECM主要由原胶原，弹性蛋白，蛋白多糖和透明质酸等组成，桥接伤口并允许血管向内生长[12]。在增殖后期，一部分成纤维细胞与巨噬细胞分化成肌成纤维细胞，肌成纤维细胞含有肌动蛋白丝，有助于引发伤口收缩[6]。成纤维细胞和肌成纤维细胞产生的ECM主要以胶原蛋白的形式存在。一旦伤口闭合，未成熟的瘢痕可以过渡到最后的成熟阶段，丰富的ECM被降解，并且早期伤口的未成熟Ⅲ型胶原被修饰成成熟的Ⅰ型胶原[12]，这些积累的胶原蛋白是瘢痕的主要成分[5]。伤口凝块向肉芽组织的转化需要ECM蛋白沉积和降解之间的微妙平衡，当该过程被破坏时可导致瘢痕疙瘩或肥厚性瘢痕形成[6]。

2 Egr1与瘢痕疙瘩

2.1 机械张力

在影响病理性瘢痕进展的众多局部因素中，最重要的是局部机械张力[3]。瘢痕疙瘩的生长方向很大程度上取决于伤口部位周围皮肤的张力方向，如胸大肌收缩时，胸廓外展，前胸壁皮肤的张力方向呈水平方向；因此，胸壁瘢痕疙瘩总是呈现水平方向生长[3]。瘢痕疙瘩好发于前胸、肩和耳垂等张力较高的部位，而眼睑、生殖器和足底等张力较小的位置通常受影响较小[6]。因此有人认为瘢痕疙瘩可能是由于真皮细胞机械感受器或皮肤感觉纤维的机械敏感伤害感受器的过度反应或功能性衰竭所致[13]。有学者发现，在瘢痕疙瘩组织中，编码机械感受器的CXCR1基因，其 mRNA的表达显著高于正常皮肤组织。该研究结果表明，CXCR1基因和蛋白表达改变与瘢痕疙瘩发展有关，强调了机械张力在瘢痕疙瘩发生发展中的重要性[13]。Egr1是一种机械敏感基因，Egr1上调以响应组织损伤或机械应力[14]。Egr1已被证明可作用于血管系统中机械信号的下游[15]，Egr1也可以感知肌腱中的机械信号并在变化时调节肌腱基因表达[16]。因此，Egr1可能作为瘢痕疙瘩的机械张力敏感位点，以影响瘢痕疙瘩的发生与发展。

2.2 炎症

2.2.1创口愈合炎症期创口愈合期间，炎症在对抗感染，清除碎片和诱导增殖期中起作用，它是愈合的必要部分。在这个阶段，浸润的血小板、巨噬细胞、成纤维细胞和其他细胞产生和分泌各种细胞因子如IL-1、PDGF、EGF、TGF-β和TNF-α，它们积累在伤口部位，通过相互作用参与多种事件包括细胞迁移、增殖、细胞外基质蛋白合成和降解，影响愈合、重塑或纤维化。因此，炎症程度和伤口局部的生长因子和细胞因子水平对于伤口愈合是重要的。然而，过度炎症也可导致组织损伤和瘢痕过度形成[5]。迄今为止的证据显示，与正常创伤愈合过程相比，瘢痕疙瘩组织中存在大量免疫细胞浸润，炎症期延长；成纤维细胞活性增加，ECM沉积更多更久[15]。据报道，IL-6和TNF-α等促炎因子在瘢痕疙瘩组织中明显增加[17]，由此推测瘢痕疙瘩患者皮肤中的促炎基因对创伤敏感性增加，即它们在真皮损伤时更容易上调；并且比其他人的相同基因更容易维持这种上调。因此也有人认为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕不是皮肤肿瘤，而是皮肤炎症性疾病[3]。与正常皮肤成纤维细胞相比，在体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中，核因子kappaB(NF-κB)活性增加，并且瘢痕疙瘩成纤维细胞的存活和发育在很大程度上取决于NF-κB信号转导。因此，也有学者认为NF-κB信号通路在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中被异常激活，导致瘢痕疙瘩炎症持续存在[17]。

Egr1可以在损伤部位通过各种急性刺激被长期诱导，包括细胞因子、氧化脂质、血管紧张素Ⅱ、缺氧、H2O2和机械损伤[12]。TNF-α是一种参与多种炎症事件的促细胞因子，主要通过激活ERK1/2诱导Egr1的表达[18]。一些研究表明，由TNF-α诱导的Egr1与肾、肝及肺的纤维化和炎症有关。Egr1通常与转录因子NF-κB协同作用，促进炎症介质的转录，导致严重的组织损伤。Egr1本身也可调节NF-κB的转录活性[19]。在Egr1缺失小鼠中，早期炎症细胞浸润减少以及随后纤维化程度下降。因此，在瘢痕疙瘩形成过程中，Egr1与炎症密切相关。

2.2.2炎症因子TGF-β TGF-β信号传导的异常活化是瘢痕疙瘩的起始和进展所必需的。TGF-β1和TGF-β2是胶原蛋白和蛋白多糖合成中最重要的刺激因子，它们不仅通过刺激胶原蛋白合成，而且通过阻止其分解来影响ECM重塑。此外，已在瘢痕疙瘩衍生的成纤维细胞中发现TGF-β1和TGF-β2的过表达[6]。在研究纤维化分子发病机制的过程中，有研究发现TGF-β可以作为诱导正常皮肤和肺成纤维细胞中Egr1表达的有效刺激[20]，并且TGF-β1基因的启动子含有至少两个Egr1结合位点，因此自发的TGF-β活化也可以通过Egr1介导，并且缺乏Egr1能够改善博来霉素诱导的皮肤和肺纤维化，减弱成纤维细胞对TGF-β的反应[19]。这种Egr1反应独立于Smad2/3，并且通过激活涉及促分裂原活化蛋白激酶(Erk1/2)和三元复合因子(Elk-1.20)的细胞内信号级联而发生[20]。Egr1通过TGF-β上调纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和纤维连接蛋白的表达[14]。抑制Egr1活性也可以通过下调TGF-β，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原来抑制肾间质纤维化[8]。因此，Egr1是纤维化背景下TGF-β信号传导的重要介质。

2.3 免疫反应类型

最近的证据表明，不仅炎症的严重程度影响个体肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的易患性，免疫反应的类型也是病理性瘢痕形成的重要影响因素[15]。T-辅助(Th)CD41细胞被认为是伤口愈合中的主要免疫调节剂[6]。Th2细胞因子假说表明纤维化是Th2主导的组织炎症的结果，其中IL-4、IL-5、IL-6和IL-13被认为与促纤维化有关，IL-10则与抗纤维化有关[5]。有研究表明IL-13通过Egr1依赖性和非依赖性途径调节下游基因转录，包括MMP-9、uPA、TSP-1和CD44在内的众多基因的表达；这也将增加活性TGF-β1的产生，并进一步刺激Egr1的产生，其可能导致纤维化病症的慢性进展或增加其严重程度。当Egr1基因被敲除后，IL-13的促纤维化作用显著降低[9]。以上表明Egr1在纤维化进程中起着至关重要的作用。

2.4 细胞增殖和凋亡

瘢痕疙瘩形成的生物学基础在于成纤维细胞的显著增殖和凋亡抑制；ECM尤其胶原的合成与降解之间的不平衡以及某些细胞因子的改变。大多数学者认为成纤维细胞的异常增殖是病理性瘢痕增生和持续存在的主要原因[17]。有研究表明，与正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞表现出显著增加的细胞增殖和抗凋亡能力；Ladin等证实瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率相对较低，这与凋亡相关基因，如p53蛋白、bcl-2和fas基因表达下降有关[17,21]。Wnt/β-连环蛋白信号通路可能通过激活细胞周期蛋白D1、C-myc、e-fos的转录[6]或者通过与端粒酶的相互作用促进瘢痕疙瘩细胞增殖并抑制瘢痕疙瘩细胞凋亡[22]。Wnt /β-连环蛋白信号通路与TGF-β信号通路之间存在交叉对话，促进纤维化和共调节[6]。Egr1已被证明参与各种细胞的增殖及凋亡过程。一方面，被激活的Egr1诱导细胞从G0进入G1期，加快细胞增殖；另一方面，Egr1还可以通过与转录因子c-Jun结合并通过激活PTEN基因来上调p53的表达，从而促进细胞凋亡[14]。因此，Egr1的过表达可能引起瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常增殖和凋亡。

2.5 上皮-间质转化(EMT)

众所周知，角质形成细胞参与伤口愈合多个进程。近期大量研究表明，角质形成细胞在异常瘢痕形成过程中具有重要作用。瘢痕疙瘩角质形成细胞在体外表现出更高的迁移率，因此有人提出角质形成细胞可以通过EMT过程直接促成纤维化[7]。有研究描述了瘢痕疙瘩角质形成细胞的基因表达谱，其揭示了涉及EMT的众多基因的异常表达，表明EMT参与瘢痕疙瘩病理过程[7]。EMT是上皮细胞失去其细胞极性和细胞-细胞粘附，侵入和迁移特性形成，并最终成为间充质细胞的过程。在EMT中，上皮细胞失去其上皮特征获得间充质性状[7]。EMT已被证实可在伤口愈合、器官纤维化和癌症发展中发挥重要作用[23]，并且EMT被认为多与疾病的侵袭、复发和耐药性有关[24]。其中Ⅱ型EMT作为修复过程的一部分在组织损伤的情况下发生，并且与炎症相关；能够在伤口愈合和炎症消退后停止或逆转。然而，在存在慢性炎症的情况下，修复过程可能会延长，导致ECM过量沉积并形成纤维化。因此，Ⅱ型EMT与组织纤维化有关[7]。TGF-β1是EMT的主要诱导因子，在EMT期间，TGF-β1信号传导通过经典途径和非经典的Smad非依赖性途径发生。例如，有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员，如ERK1/2和p38 MAPKs。总之，结果表明TGF-β1/ Smad2/3和ERK1/2信号传导途径调节部分重叠，以调节瘢痕疙瘩中角质形成细胞的迁移和粘附[7]。Ma等证明EMT现象存在于瘢痕疙瘩组织中，并且在低氧条件下，HIF-1α上调波形蛋白和纤维连接蛋白的表达，下调瘢痕疙瘩角质形成细胞中E-钙粘蛋白和ZO-1的表达。也就是说，低氧促进EMT现象并增强瘢痕疙瘩角质形成细胞的侵袭能力[23]。

最近研究表明，缺乏Egr1的皮肤成纤维细胞在体外表现为迁移减少和肌成纤维细胞转分化；相反，成纤维细胞特异性Egr1过表达的转基因小鼠表现出极强的组织修复能力、胶原蛋白积聚增加和伤口的拉伸强度增强[20]。这些研究结果证明，Egr1参与皮肤成纤维细胞EMT过程。有研究表明Egr1参与肾小管EMT ，影响肾纤维化[15]。也有人提出miR-301b通过靶向调节膀胱癌中Egr1，从而增强EMT信号传导途径，抑制BLCA细胞迁移和侵袭[25]。因此，我们认为，Egr1可能通过影响TGF-β1，参与瘢痕疙瘩的EMT过程，进而影响瘢痕疙瘩的纤维化进程。