Protocells药物递送系统的模块化设计与应用

牟家慧，李桂玲

·综述·

Protocells药物递送系统的模块化设计与应用

牟家慧，李桂玲

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所制剂室

随着多种新型纳米载体的出现，药物递送已实现复杂的功能性递送形式。通常认为，理想的功能性纳米载体应具有以下特征：高水平的药物携带能力、抵抗免疫或排泄系统消除的体内长循环能力、与靶细胞或靶器官的高度特异性结合能力、控制药物释放或细胞内转运途径的能力以及低免疫原性和毒性等。此外，由于纳米载体的体内分布和生物相互作用等可以在不同个体环境中变化，因此理想的纳米载体还应该具有可调节的性质，即能够针对特定应用对象进行调整的物理、化学以及生物学等性质。Protocells 是近年来出现的一种将介孔二氧化硅纳米粒子（mesoporous silica nanoparticles，MSNP）与脂质双分子层（lipid bilayer，LB）融合所形成的纳米药物递送系统[1]，其在特异性靶向药物递送或多种性质药物共递送等方面表现出优势与应用潜力。

1 Protocells 药物递送系统概述

脂质体是一种具有良好的生物相容性、细胞亲和性以及低免疫原性的纳米载体，并且具有高度的表面修饰潜力，广泛应用于抗肿瘤药物治疗以及靶向药物递送等方面[2]。然而脂质体作为药物载体的明显缺陷在于大分子载体包覆所导致的低载药量以及血液环境中难以控制的稳定性问题。因此，如何防止其负载的药物在体内循环过程中过早泄漏，依然是脂质体给药系统开发过程中的重要挑战之一[3]。与脂质体类似，许多基于高分子聚合物的纳米载体可自发组装且具有生物友好性，但是它们的体内稳定性和剂量依赖的毒性成为限制因素[4]。此外，脂质体和聚合物纳米颗粒通常具有不可变的尺寸和形状、不可控的药物释放曲线以及递送载体各种性质之间的高度相互依赖问题，因此改变一种性质，例如负载效率，会不可避免地影响许多其他性质，如尺寸、电荷、稳定性等[1]。

脂质体递送系统的上述种种局限性问题，恰是 MSNP 作为药物载体的优势所在。与脂质体相反，MSNP 具有相对可控的尺寸、形状和极高的比表面积，从而表现出药物的高负载量以及广泛而灵活的负载能力。通过调节粒子内部孔径尺寸与表面化学性质，可以包载不同类型的药物[5]。然而，MSNP 用作纳米载体也存在弊端，如注射后引发机体免疫系统吞噬和受到排泄系统快速清除颗粒的限制等[1, 6]。如果在 MSNP 表面包裹类似脂质体的膜结构，则能够使递送系统有效避免上述不良作用。

综上所述，MSNP 纳米粒给药系统与脂质体靶向递送系统各有局限性，又能够优势互补。基于此，研究者们将脂质体固有的低毒性、低免疫原性和生物友好性的优点，与MSNP 纳米粒子尺寸和孔径可调、稳定性好以及广泛的药物负载能力相结合，开发了一种灵活的模块化纳米载体，称之为“Protocells”，可同时解决纳米药物递送的特异性、稳定性以及载药效率等问题[7-8]。除了综合 MSNP 和脂质体系统的各自优势，MSNP 和 LB 之间的融合能够在一定条件下改变二者的存在形式，产生新的性能。例如，MSNP 内核的支撑能抑制脂质体大规模脂质双层的波动所造成的不稳定性，阻止药物泄漏；而脂质双层的包覆将可溶性药物更好地截留在载药粒子内部等。

2 Protocells 药物递送系统的模块化设计思路

最早的 Protocells 纳米载体由气溶胶辅助蒸发诱导的二氧化硅与表面活性剂自组装形成的亲水性球型内核，与两性离子/阳离子（DOPC/DOTAP）或两性离子/阴离子（DOPC/DOPS）脂质双分子层融合而成[9]。其中，脂质囊泡同时发挥负载和包封 MSNP 中带负电荷的药物，并且使其具有递送穿过细胞膜的作用。在此基础上，随着 Protocells 在药物递送方面应用研究的深入，模块化设计的多功能 Protocells 载药纳米粒相继出现，实现了多种给药思路与模式。包括①利用脂质单层包封疏水 MSNP 内核[9]；②通过脂质与二硫化物的共价连接，实现药物在还原条件下的化学触发释放[10]；③脂质双层或单层表面的高分子修饰以实现多种递送功能[11]；④利用天然细胞膜如红细胞膜代替磷脂分子包封的无机纳米颗粒[12]等不同的药物递送模式。Protocells 的双载体复合结构赋予其介孔硅纳米颗粒与磷脂双分子层的组合属性，同时又各自独立的药物递送特点。因此，可以利用模块化设计的思路，将 Protocells 的外膜与核心分别构建合成、定向修饰以及功能性改造，然后融合形成完整的药物载体，使其兼具二者优化的递送性质，以得到最佳给药系统。

3 Protocells 药物递送系统的模块化设计与应用

3.1 Protocells 内核 MSNP 的设计与功能应用

3.1.1 通过调节 MSNP 粒子的大小、形状得到不同性质的 Protocells 内核 常见的制备胶体二氧化硅颗粒的方法，可以合成大小均一的球形、棱柱形、环形、棒状或中空形状的 MSNP 粒子群，尺寸范围从 25 ~ 250 nm，在多数情况下能够使其多分散指数 PDI < 0.1。其形状可以通过物理、化学及生物学等多种手段进行设计与改造，不同的形状适应承载不同类型的药物以及不同的递药途径。

研究表明，载药纳米粒与细胞间的相互作用也受粒子形状的影响。有研究设计了长宽比（AR）分别为1.5（短杆）、5（长杆）的两种不同形状荧光 MSNP，考察颗粒形状对其在小鼠体内生物分布、清除率和生物相容性的影响。结果表明，静脉内施用的 MSNP 主要存在于肝、脾和肺中（> 80%），其中短杆 MSNP 容易聚集在肝脏中，而长杆 MSNP 则更多分布在脾脏中。而且 MSNP 的清除率也与颗粒形状有关，尿液和粪便两种排泄途径中，短杆 MSNP 的清除率均比长杆 MSNP 更快[13]。

有研究通过构建 MSNP 库来考察其生物学性质与粒子形态的关系。该库覆盖一定范围的不同尺寸 MSNP。结果证明杆状粒子的长宽比决定了细胞对纳米粒子摄取的速率和丰度。负载紫杉醇或喜树碱 MSNP 的体内输送过程中，AR 为 2.1 ~ 2.5 范围的 MSNP 被细胞大量摄取，即该棒状 MSNP 能够更有效地递送抗肿瘤药物到 HeLa 细胞和 A549细胞中产生杀伤细胞的作用。基于 HeLa 细胞和 A549 细胞能够感知不同 AR 值 MSNP 的差异，可以利用加速的胞饮作用构建一种被动靶向摄取机制的递药系统以提高药物的摄取[14]。

3.1.2 利用 MSNP 的孔径调节药物的包载与释放 通过自组装的方法，MSNP 的内孔径亦可以在 2 ~ 20 nm 范围内进行调控，并且通过改变孔隙表面化学性质可以使载体适应不同浓度的不同治疗剂。例如，通过孔内表面和外表面的硅烷醇基团（≡Si-OH）与烷氧基或氯硅烷衍生物反应，可以引入多种有机官能团。进行化学修饰的过程中调节内孔和外部颗粒表面的电荷、极性以及疏水亲水特性，药物和其他成分可以通过吸附或毛细管填充作用来加载，并且结合孔径大小和孔表面化学性质来调整释放曲线，为药物递送提供更多的选择与策略[15]。

目前已有用于将药物密封在载体内，并能够在光、pH、或氧化还原等条件刺激下触发释放的介孔二氧化硅材料，用刺激响应部分进行修饰，这些部分可以作为孔阻断剂并在特定刺激下介导药物释放[16]。有研究开发了一种结合了光敏性材料二硫化钼（MoS2）纳米片的近红外（NIR）反应性 PEG 化介孔有机二氧化硅纳米颗粒（MSNs），用于乳腺癌的化学光热疗法[17]。将药物阿霉素（DOX）包封在纳米颗粒中，其扩散被 MoS2/PEG 涂层阻止。观察到，MoS2/PEG MSNs在 NIR 激光辐照下（808 nm，1 W/cm2持续 5 min），温度升高至 50 ℃，内部药物释放。数据结果显示，在没有 NIR 激光照射的情况下，1 h 内只有不到 1%的 DOX 释放；而在 NIR 照射下药物释放率增加到 16%。其原因是 MoS2的发热和随之产生的振动在 MSNs 的表面形成一层薄层，减少了药物/纳米颗粒的相互作用，并增加了 DOX 分子的运动。

3.1.3 通过介孔硅分子结构的设计调节药物的体内过程 MSNP 内核合成过程中硅氧烷缩合的程度，可以在一定程度上决定二氧化硅的溶解速率，从而控制其中所包载药物的释放，并通过改变 MSNP 的入胞和出胞途径控制药物的细胞内摄取与分布[18]。

对介孔二氧化硅纳米颗粒进行癌细胞的摄取研究以及细胞内分布与入胞出胞的过程考察。结果表明，该纳米体系通过能量依赖性内吞作用摄取入胞，其中大部分分布到癌细胞溶酶体区室。现有研究提出了 MSNP 胞吐作用的可能机制，即被内吞的纳米颗粒定位于溶酶体，随后进入高尔基体进行排泄，或经历溶酶体的胞吐作用。通过追踪具有表面修饰的 MSNP 的路径发现，Protocells 主要通过溶酶体胞吐作用离开细胞，且通过胞吞作用进入到细胞中的载药 Protocells，在从细胞中排泄出来后仍可以恢复原状，此过程是通过溶酶体与质膜融合而介导的，因此，其出胞过程可以通过影响溶酶体胞吐作用来调节[19]。由于 Protocells 中药物的释放过程是通过扩散作用实现的，所以载体在细胞内的停留时间会直接影响药物的释放量。通过降低载有喜树碱的 Protocells 的胞吐速率，发现递送药物的细胞作用有所提高，进一步证实了这一判断。此外对通过胞吐作用离开细胞的 Protocells 进行收集分析，发现颗粒的形状和外观与细胞摄取前相似，利用依诺霉素诱导提高溶酶体胞吐率会加速载药 Protocells 离开 A549 细胞。这些结果提示，在设计抗肿瘤药物等递送系统时，可以通过一定的修饰调节纳米粒子的出胞速率以控制药物的定位或定量释放[14]。

3.2 Protocells 外层脂质双分子的功能化修饰与应用

Protocells 的脂质双分子层是由脂质分子自发组装而成，具有密封性和保护性，且由于其在酸性条件下稳定性降低以及细胞膜融合等特性，可实现 pH 值触发的内部药物释放以及药物的细胞摄取效率提高等。此外，通过对脂双层表面进行特异性分子修饰，使其与细胞表面复杂的生物分子相互作用，可实现包括靶向、免疫细胞逃避、内涵体逃逸等多种功能递送[20-21]。

3.2.1 脂质包覆提高 Protocells 的稳定性，减少非特异性吸附 MSNP 在生理环境（或缓冲盐溶液）中易发生聚集现象，以及在血清（或含蛋白质的溶液）中的非特异性结合所导致的应用限制，可通过磷脂包覆加以解决[6, 22]。

Wang 等[6]开发了一项技术，将多种大分子链嵌段修饰的磷脂包覆到 MSNP 表面，选择叶酸作为目标配体，比较裸露 MSNs（bareMSNs）、磷脂包覆的 MSNs（LipoMSNs）、叶酸修饰的磷脂包覆 MSNs（folate-LipoMSNs）在 HeLa 细胞中的摄取情况。结果表明，bareMSNs 的摄取主要通过非特异性结合或吸附发生；LipoMSNs 能够抵抗非特异性吸附，使内化颗粒减少；而 folate-LipoMSNs 能够穿越细胞膜实现细胞内化，且细胞吞噬的纳米颗粒数量增加。上述结果表明，脂质膜的存在能够避免纳米粒子的非特异性吸附，而靶向肽与配体的特异性结合提高了 Protocells 的靶向递送水平。此外，以细胞膜表面叶酸受体阴性表达的 A549 细胞作为对照发现，folate-LipoMSNs 在 A549 细胞中的吸收（40%）明显低于在 HeLa 细胞中的吸收（99.06%）。综上，相对于裸露的介孔二氧化硅材料，脂质膜包覆的纳米颗粒在水性缓冲溶液中表现出更好的悬浮性，减少聚集与吸附作用，从而降低了与细胞的非特异性结合，提供更好的抗调理作用，具有潜在的临床应用价值。

Protocells 在生理条件下孵育过程中表现出优越的稳定性，可以作为核酸药物递送载体，保护 siRNA 免受血浆核酸酶降解，使其在体内实现长循环，并且能够在病变部位沉积，选择性与靶细胞相互作用，通过内化的方式释放到胞质溶胶中，并通过RNA 诱导沉默复合物（RISC）途径发挥治疗作用[9, 23-24]。

3.2.2 SP 94 靶向肽修饰 DOPC Protocells 实现药物的定位释放 对 DOPC Protocells、DOPC 脂质体、纳米多孔硅三种不同纳米载体，分别在 pH 5.0 和 pH 7.0 的 1 mmol/L KCl 条件下进行 zeta 电位测量。结果显示，在 pH 7.0 缓冲液中，三种纳米载体的 zeta 电位值随时间无明显波动，较为稳定；而在模拟体内酸性环境的 pH 5.0 缓冲液中，Protocells 的界面电位值随时间呈明显下降趋势，证明酸性条件会破坏 Protocells 脂质层的稳定性[25]。使用 SP 94 靶向肽修饰的 DOPC Protocells 将药物递送至人肝癌细胞（HCC）过程中，内涵体的酸化环境使其内部包封的药物由纳米多孔核心扩散出来，实现了目标药物的细胞器定位释放[9, 26]。

3.2.3 TPGS 脂质分子包覆疏水MSNP 实现耐药细胞的药物递送 多药耐药性（MDR）是化疗药物临床治疗失败的主要原因之一。有研究报道，通过设计一种多组分混合脂质包封的 Protocells 实现药物的可控性释放以规避 MDR 效应。采用疏水链进行表面修饰的 MSNP 作为 Protocells 的内核，将d-α-生育酚聚乙二醇1000 琥珀酸酯（TPGS）脂质分子通过疏水作用自组装，形成包围在内核表面的脂质双分子层，利用内核和脂质层之间的相互作用封堵内核的孔道，并充当智能阀以实现环境响应性释放。利用上述 Protocells 载体包载阿霉素（DOX），得到粒径为 190 nm、可稳定分散于体液中的纳米粒子。该载药纳米递送系统在体内具有较长的循环时间以及理想的 EPR 效应，并可以实现氧化还原和 pH 值触发的 DOX 释放。由于其表面含有 TPGS 脂质层，因此与 DOX 溶液相比，Protocells – DOX 递送系统在耐药 MCF-7 细胞和 Adr 细胞中表现出更高的摄取效率、更强的细胞毒性和更高的细胞内蓄积量，并能实现药物的长循环与特异性胞内释放[9]。

3.2.4 靶向肽和内溶肽修饰脂质双层实现细胞的特异性结合和内化 催化活性蓖麻毒素 A 链（RTA）作为一种肿瘤特异性免疫毒素，可以抑制多种生长模式的癌细胞而展现出抗肿瘤的应用潜力。然而，体内环境中针对抗体或毒素的免疫反应，常导致患者体内毒素浓度不足以达到成功清除癌细胞之所需[27]。Epler 等[8]构建了靶向肽修饰的高容量负载RTA 的 Protocells，特异性地杀伤 HCC 靶细胞。其中球形多孔二氧化硅纳米粒核心包载药物——蛋白毒素 RTA。聚乙二醇化脂质膜融合到载药核心外层，可防止药物过早释放，改善胶体稳定性，并减少免疫细胞的清除作用。同时，在脂质双层表面进行靶向肽和内溶肽的修饰，实现细胞的特异性结合和内化，以及包封的药物顺利递送至胞质区。

3.3 利用 Protocells 中核壳间的相互作用调节其扩散性

Protocells 结构中脂质双层的流动性赋予其灵活可控的生物学功能，MSNP 的支撑使得这种流动性受到与内核相互作用的影响而产生特殊的运动性质[28]。

在 Protocells 的核-膜复合结构中，由于存在底物-膜黏附能，多孔粒子核心 MSNP 能够抑制 LB 进行大范围的双层波动，比无支撑的脂质体具有更好的稳定性。但同时，与在无孔纳米颗粒表面形成的脂质体或单一结构的 LB 相比，Protocells 中 MSNP 支撑的 LB 具有独特的长程流动性，这种脂质双层流动性的增强，可能是磷脂双分子层和二氧化硅多孔载体二者界面处存在独特的相互作用的结果[29]。

Protocells 脂质层的横向扩散性质，使膜表面修饰的靶向配体与细胞表面受体之间具有低配体密度条件下的高亲合力，并能够降低免疫原性，实现非特异性结合。Ashley等[7]将脂质囊膜与高比表面积的 MSNP 核心融合，得到 MSNP 支撑的脂质双层，并在 LB 上修饰人肝细胞癌（HCC）靶向肽、融合肽和 PEG 长链，得到一种新结构的靶向载体。由于外侧 LB 横向流动与扩散的增强，DOPC 与 DPPC Protocells 在低目标肽（配体）密度下均表现出特异性靶向 HCC 细胞的性质。这种增强的外侧脂质双层的流动与扩散，使得利用较少数量靶向肽修饰的 Protocells 就能够选择性地结合靶细胞并被靶细胞内化，对于降低剂量和减轻免疫原性至关重要，解决了同时实现高靶向特异性，对靶细胞（癌细胞）的高细胞毒性和对非靶细胞（正常细胞）的低附带损伤问题。

3.4 Protocells 药物递送系统的应用实例

3.4.1 霍乱毒素-B 修饰的 Protocell 靶向运动神经元 神经肌肉疾病目前常采用神经营养蛋白作为治疗剂，但受到生物利用度与脱靶作用等的阻碍。有学者构建了一种霍乱毒素-B（CTB）修饰的 Protocells 用于靶向神经-肌肉接头（NMJ）的药物递送，结合了介孔二氧化硅的高水平药物负载能力以及 CTB 靶向 NMJ 细胞的能力，提供了一种针对运动神经元的新型纳米颗粒递送平台[14, 30]。

3.4.2 负载血红蛋白的 Protocells 模拟红细胞功能 利用大孔径（10 nm）的 MSNP 作为刚性核，将血红蛋白（Hb）封装于孔内，然后将脂质膜融合到载 Hb 的 MSNP 外表面上，堵塞其孔隙，可有效防止 Hb 过早释放[突释率从（25.50 ± 0.33）% 降低到（6.73 ± 0.83）%]，并增加了 Hb-MSN 的胶体稳定性（粒径 250 nm，一周内保持不变），同时 Hb-protocells 表现出与来源 Hb 相似的活性。以斑马鱼胚胎作为体内实验模型，将荧光标记的 Hb-protocells 注射入血液，发现纳米颗粒高速流动，并迅速分布在全身血液循环中。因此，这种负载有 Hb 的 Protocells 可以被视为人造红细胞模拟物[4, 19]。

3.4.3 Protocells 作为蛋白质的选择性高效递送平台 有研究人员构建了一种可以高效递送蛋白质的介孔二氧化硅纳米粒子和脂质融合物结构[26, 31]。通过对 MSNP 的表面修饰，带正电的 MSN（MSN+）和带负电的 MSN（MSN–），可以选择性并高效地装载不同的蛋白质，脂质融合显著提高纳米系统在生理条件下的稳定性。这种 MSNP-LB 结构可以有效地将 15 种不同的蛋白质如荧光蛋白、光敏蛋白（KillerRed）、超氧化物歧化酶（SOD）等递送到细胞中释放。进一步的实验结果表明，蛋白质在递送到细胞后可以维持其功能，荧光蛋白细胞中可显示荧光，KillerRed可以在细胞中产生活性氧（ROS），而 SOD 可以消除细胞中的 ROS，由该系统递送的蛋白质在细胞中保持其结构和功能。

4 Protocells 药物递送系统的发展前景

Protocells 递药系统的模块化设计与多功能联合作用使其在药物递送方面得到快速发展。对MSNP 核心、外部脂质双层以及靶向化学物质或包载药物进行特定的修饰改造，可构建出应用于特定靶点与治疗目的载药纳米粒子，极大地提高了 Protocells 特异性功能性药物递送的潜力。然而其应用依然存在许多限制与弊端，与基于高分子化合物的聚合物或脂质体等相似，Protocells 作为抗肿瘤药物载体实现靶向递送过程中，同时依赖于 EPR 效应介导的被动靶向以及受体配体相互作用介导的主动靶向，然而大分子靶向肽等表面修饰可能改变纳米粒子在体内循环过程中的大小或形貌从而削弱其 EPR 效应[32]，并且，许多实验数据停留在体外阶段。因此，Protocells 结构为纳米药物递送提供了一个新的思路与平台，其优势与限制并存，还需进一步的探索与验证。

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·协会之窗·

2019 年 11 月，中国医药生物技术协会与诺华中国、南京传奇生物科技有限公司共同开展启动了医疗机构 CAR-T 上市产品临床应用规范制订项目。协会组织相关领域专家，多次召开研讨会，就 CAR-T 上市产品进入临床应用的相关问题进行专项讨论，起草了《开展嵌合抗原受体修饰 T 细胞上市产品临床应用医疗机构的标准》，对开展 CAR-T 上市产品临床应用的医疗机构应当具备的条件提出要求。近期，协会将组织专家对其进行修改完善，力争将此规范作为协会团体标准发布并提交有关政府管理部门参考。

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.016

李桂玲，Email：liguiling1999@163.com

2020-03-02