大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因二重PCR 技术的建立

（四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066）

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌，为肠杆菌科埃希氏菌属，由Escherich 在1885 年发现。该菌大小0.5 μm×（1～3）μm，周生鞭毛，能运动，无芽孢。绝大多数大肠杆菌对人与动物有益，但是仍有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力，一旦感染，可能会造成严重疫情[1]。

磺胺类抗生素（sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物[2]。它通过干扰细菌的叶酸代谢而抑制细菌的生长繁殖。细菌与药物反复接触后，易产生耐药性，磺胺类抗生素也不例外，耐药性严重影响抗生素药物的效能。细菌对磺胺类药物和甲氧苄啶的耐药性与五种主要机制有关，包括：（1）通透性屏障；（2）天然不敏感的固有二氢叶酸还原酶（DHFR）；（3）与叶酸途径有关的固有二氢叶酸合成酶（DHPS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的自发突变；（4）通过上调基因表达或基因复制来增加敏感靶酶的产生；（5）通过整合子、质粒和转座获得替代二氢叶酸合成酶（Sul）和二氢叶酸还原酶（dfr）基因[3-4]。迄今为止，已在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌[5-8]中描述了4 种不同的Sul替代基因（Sul1，Sul2，Sul3和Sul4）和40种不同类型的dfr替代基因。因此，检测耐药基因对于养殖生产中合理用药具有良好的指导意义。

对于耐药基因检测，目前主要有药敏试验[9]、PCR 检测方法等。前者耗时耗力，花费时间较长，而常规的PCR 检测方法一次只能检测一种耐药基因。因此，本次研究旨在建立一种一次性检测多个耐药基因的省时省力检测方法，便于及时在生产实践中指导用药，提高养殖效率。

1 材料与方法

1.1 所用菌株

试验用菌株由本实验室在生产猪场的废弃物中分离，已经过药敏试验鉴定具有磺胺类抗生素耐药性。经传统PCR 检测方法确认，同时具有Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因的大肠杆菌作为阳性菌株。另外，选择2 株已经过药敏试验鉴定，具有磺胺类抗生素耐药性，传统PCR 检测方法已确认不具有Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因的大肠杆菌作为特异性试验菌株。同时选择已经过药敏试验鉴定，具有磺胺类抗生素耐药性的沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌作为特异性试验菌株。

1.2 主要试剂及培养基

2×PCR Mix、Marker 等，均购自Tiangen 公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 引物

根据Domínguez 等[10]研究成果，针对大肠杆菌Sul1和dfrA1两个基因各设计一对引物（表1），由英骏生物技术有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.4 PCR 反应体系及条件

反应体系（25 µL）：2×PCR Mix 12.5 µL，模板1 µL，两种上、下游引物各0.5 µL，用ddH2O补足至25 µL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 敏感性试验

对试验用阳性大肠杆菌进行平板计数，计算大肠杆菌浓度。取原液，分别进行10-1～10-5稀释，每个稀释度样品各1 µL 作为模板敏感性检测。

1.6 特异性试验

将传统PCR 检测方法确认，不具有Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因的2 株大肠杆菌和已经过药敏试验鉴定，具有磺胺类抗生素耐药性的沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌作为模板进行特异性检测。

2 结果

2.1 有效性

通过对3 株试验用大肠杆菌检测发现，本方法能顺利地检测出Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因（图1）。

图1 二重PCR 检测结果

2.2 敏感性

将试验用阳性大肠杆菌进行平板计数后，发现浓度为4.5×107cfu/mL。将其进行10-1～10-5系列稀释，每个稀释度各取样品1 μL 作为模板敏感性检测，结果发现10-3稀释度样品仍出现两个条带，10-4和10-5两个稀释度样品已无条带（图1）。这说明本方法的检出限为4.5 cfu/μL。

2.3 特异性

将经过药敏试验鉴定，具有磺胺类抗生素耐药性，且传统PCR 检测方法已确认不具有Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因的2 株大肠杆菌作为模板进行检测，发现并不能检出这两种基因。同时，也不能检出经药敏试验鉴定，具有磺胺类抗生素耐药性的沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌（图1）。这说明本方法对于Sul1和dfrA1两种大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因具有较强的检出特异性。

3 讨论

目前，已有大量关于磺胺类抗生素耐药性检测的报道[3-5]，大多采用常规PCR 检测方法，针对单一磺胺类抗生素耐药基因进行检测。这类检测方法灵敏度、准确率高，在生产实践中得以广泛运用。然而由于这些传统PCR 检测方法一次只能检测单一磺胺类抗生素耐药基因，对于同时检测多种磺胺类抗生素耐药基因，操作较为繁锁、费时费力。本研究针对不同类型的两种磺胺类抗生素耐药基因同时检测，检测结果准确可靠。

研究中的二重PCR 检测比传统PCR 灵敏度要低一些。这可能是由于PCR 反应的原理决定的[11-12]。PCR 反应中，上下游引物分别结合在模板上，指导DNA 聚合酶启动并依照模板完成DNA 合成。在二重PCR 反应的反应体系中存在多对引物，这些引物在结合模板时，相互竞争，在模板浓度较低时，多对引物竞争的结果，必然会导致多重PCR检测方法的灵敏度低。

本研究采用大肠杆菌建立了磺胺类抗生素耐药基因二重PCR 检测方法。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，没有细胞壁，可直接进行菌落PCR 检测，省去了提取DNA 的麻烦。对于其它细菌，除了个别革兰氏阳性菌，由于存在细胞壁而不能直接进行菌落PCR 检测外，操作大致是相同的。但是，本方法并不能检出沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的磺胺耐药基因，这可能是由于宿主细菌不同，而导致这些耐药基因在DNA 序列上有少许的差异。因此只需要在引物序列上进行必要的调整，就可以采用本方法对其它细菌进行磺胺类抗生素耐药基因检测。

本研究建立的大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因Sul1和dfrA1的二重PCR 检测方法，特异性高、操作简单方便，为检测此类耐药基因提供了有力的技术支持。