对虾急性肝胰腺坏死综合征不同检测方法结果分析

2020-01-08郭书林尤颖哲陈何东王艺红陈信忠丁亦男龚艳清杨俊萍陈长乐陈炳颖

中国动物检疫 2020年1期

郭书林，尤颖哲，陈何东，王艺红，陈信忠，丁亦男，龚艳清，杨俊萍，陈长乐，陈炳颖

（1.厦门海关，福建厦门 361016；2.漳州市水产技术推广站，福建漳州 363000）

我国对虾养殖已有很长的历史，但人工规模化养殖只有几十年时间，其间因暴发性传染病等原因，经历了从起始、兴旺，到衰退和恢复的发展过程。其中，副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）被认为是首要致病菌。2009 年，我国暴发一种对虾疫病，随后传播到越南（2010 年）、马来西亚（2011 年）、泰国（2012 年）。这些对虾疫病的主要特征是急性肝胰腺坏死，发病阶段为养殖早期的35 d 左右。2013 年，确定该病病原是某种细菌，初步确认为一种VP，同时确定该病为急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）[1]。研究[2-3]报道，该种菌株因携带了一种130 kb 大小的毒力质粒pVA1 而具有特殊的毒性，可以引起对虾肝胰腺上皮细胞大量脱落等病理症状的急性肝胰腺坏死综合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）。这种致病性VP 给对虾养殖业造成严重危害，但不会引起腹泻。

生化鉴定和血清学分型是检测鉴定细菌的经典方法。PCR 技术通过对生物体的特异性RNA 或DNA 进行识别，已被广泛应用于水生动物的病原检测、鉴定。目前，一种AHPND PCR 检测方法所用引物为AP3，其以一种毒力基因（序列分析显示该基因编码的蛋白质与细菌抗昆虫毒素具有显著的同源性）片段为扩增靶标，具有较好的准确性和灵敏性[4]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是近年来发展起来的一种通过识别细菌表面蛋白的特异性而对细菌进行快速检测鉴定的方法[5]。本试验通过生化鉴定、血清学分型、MALDI-TOF-MS 鉴定，以及以AP3 为引物的PCR 方法，分别对从福建省南美白对虾养殖场中分离到的9 株VP 进行检测，比较各种方法检测结果的一致性、相关性，从而确定一种准确快速检测AHPNS 的方法。

1 材料与方法

1.1 样本处理

从福建省9 家规模化南美白对虾养殖场，各采集10 只患病幼虾活体，共90 份样本，取肝胰腺。

1.2 主要仪器

MALDI Biotyper 高通量微生物鉴定系统：德国Bruker Dahonics 公司生产，参数设置为线性操作模式、正离子、基质抑制偏转模式，脉冲离子提取时间为100 ns，相对分子质量为2～20 kD；VITEK-2 全自动细菌鉴定系统：法国生物梅里埃公司生产。

1.3 主要试剂

VP 诊断血清：宁波天润生物药业有限公司产品；VP 分离纯化用培养基：青岛海博公司产品；PCR mix 反应液：天根生物科技有限公司产品；PCR 引物：上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 弧菌分离将1.1 中所述的90 份肝胰腺样本，分别在TCBS 和弧菌显色培养基平板中划板，37 ℃培养24 h，挑取可疑单菌落在营养琼脂培养平板上划线培养，编号备用。

1.4.2 生化鉴定取营养琼脂培养平板上纯化培养的菌落，用比浊仪将所检测细菌浓度调整到0.5～0.63 麦氏浊度；利用VITEK-2 中的GN 卡，对VP 可疑菌株进行检测。

1.4.3 MALDI-TOF-MS 鉴定挑取营养琼脂培养基上的单个菌落于1.5 mL 离心管中，加入1 mL生理盐水，混匀、离心，洗涤2 次；将清洗干净的细菌加入300 μL 无菌水，混匀后加入900 μL 无水乙醇，混匀，室温固定3～4 min，10 000 r/min离心2 min，弃上清；向沉淀中加入50 μL 70%甲酸，混匀后再加入50 μL 乙腈，混匀；室温放置3～4 min，10 000 r/min 高速离心2 min，吸取上清点靶；点1 μL 上清于样品靶盘上，同时点1 μL标准溶液（校准），待液体干后立即点1 μL 基质溶剂。通过flexControl 软件，采集数据图谱；通过Biotyper 软件对质谱图进行分析和鉴定。得分2.300～3.000，表示可完全达到鉴定到种的水平；得分2.000～2.299，表示可靠鉴定到属的水平，有可能鉴定到种的水平；得分1.700～1.999，表示有可能鉴定到属的水平；得分0.000～1.699，表示没有可信的鉴定结果。本研究均选取分值≥2.300 的结果作为待测样本鉴定结果。

1.4.4 血清学鉴定按照国家标准GB 4789.7—2013 的操作方法，使用抗O 和抗K 抗体，测定弧菌体（O）抗原和荚膜多糖（K）抗原血清型。

1.4.5 PCR 检测取营养琼脂培养基上的菌落，按照商品化核酸抽提试剂盒的操作方法提取 DNA，并以此作为PCR 检测用模板。反应体系为：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3 上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL、TaqDNA 聚合酶0.5 μL、提抽物5 μL，加水补至25 μL。按照以下程序进行扩增：94 ℃ 5 min，然后进行32 次循环（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃5 min，4 ℃ 保温。PCR 检测通过引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1 ）和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）扩增质粒pVA1 的基因片段，目的片段大小为336 bp。PCR 产物经测序、Blast 比对后，确定分离所得的菌株是否为引起AHPND 的VP 分离株。

2 结果

2.1 菌株分离

将从福建省9 家规模化对虾养殖场采集的90份样本，经划线分离培养后，从各样本长有可疑VP 菌落的TCBS 和弧菌显色平板上，挑取≤5 个菌落进行VITEK-2 生化鉴定。其中从6 家养殖场样品中分离到VP 菌株数量分别是21、21、13、12、10 和4 株，总计81 株。从检出VP 菌株数量≥13 的3 家养殖场中，分别随机选取2 个样本中的VP 分离株各1 株（共6 株）；从其余3 家养殖场，分别随机挑取VP 分离株各1 株（共3 株）。以这9 株VP 分离株作为MALDI-TOF-MS 鉴定、血清学分型、PCR 检测用样本。

2.2 MALDI-TOF-MS 鉴定

对2.1 中所述的9 株VP 分离株进行MALDITOF-MS 鉴定。FT-18-1、FT-18-3、FT-18-4、XA-18-1 号分离株检测得到的结果与VP 4a ISB 的匹配值分别为2.438、2.421、2.372、2.443；FT-18-2、XA-18-2、XA-18-3、XA-18-4、XA-18-5 号分离株检测得到的结果与VP CCM5937 的匹配值分别为2.375、2.453、2.439、2.387、2.406；9 株分离株与MALDI-TOF-MS 中VP 数据库匹配值均大于2.300，表明鉴定结果可信度很高。

2.3 血清型测定

对9 株VP 分离株血清型进行测定，发现4 株为O1:KUT 血清型，3 株为O1:K68 血清型，2 株为O3:K6 血清型。其中：O1，菌体抗原为13 种血清群中编号为O1 的血清群；KUT，荚膜抗原的血清型不能分型；K68，荚膜抗原的血清型为65 种血清型中编号为K68 的血清型；O3，菌体抗原为13 种血清群中编号为O3 的血清群；K6，荚膜抗原的血清型为65 种血清型中编号为K6 的血清型。

2.4 PCR 检测

对9 株分离株进行PCR 检测，发现4 株为引起AHPND 的VP 分离株，其余5 株未扩增出目的片段，判为阴性。9 株菌株的血清学、MALDITOF-MS、VITEK-2 和PCR 鉴定结果见表1。

表1 9 株菌株的血清学、MALDI-TOF-MS、VITEK-2 和PCR 鉴定结果比较

3 分析与讨论

本试验结果显示，MALDI-TOF-MS 鉴定方法对AHPND 的PCR 检测呈阳性和阴性的VP 均可以进行菌种的准确鉴定，且与经典的VITEK-2 鉴定结果吻合，说明这种新发现的AHPND VP 变异株不影响MALDI-TOF-MS 菌种鉴定的准确性。同时，MALDI-TOF-MS 技术较之于细菌生化鉴定方法更加简便快捷，在AHPND VP 菌株的分离鉴定中，可以提高检测效率；将MALDI-TOF-MS 与PCR 检测方法相结合，在AHPND 的病原学分析、流行病学调查以及诊断、监测中可以取得准确的测定结果。

本研究发现，引起AHPND 的VP 分离株血清型为O1:KUT 和O1:K68，结合Kongrueng 等[6]在其研究中测定到的AHPND VP 血清型包括O1:KUT、O1:K33 和O1:K68，可以看到所测定的AHPND VP 分离株均为O1 血清型，而K 抗原血清型至少有3 种。根据上述情况可以假设，由两种情况导致AHPND VP 血清型不同[6]：一种假设是，最初1 个VP 克隆变异为AHPND VP，随后变异为多种血清型的AHPND VP；另一种假设是，致病质粒转化进入了具有不同血清型的VP。因此目前分离到的AHPND VP 具有多种血清型。然而后一种假设很难解释为什么没有测定到除O1 血清型之外的AHPND VP。AHPND VP 是否在MALDI-TOF-MS测定中具有某些特征，还需要通过建立MALDITOF-MS 中大量AHPND VP 分离株分析结果的数据库才能获得。