牛结节性皮肤病及其检测方法研究进展

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830000）

牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的一种病毒性传染病，又称为牛疙瘩皮肤病、牛结节性皮炎和牛结节疹。LSD属于急性和亚急性传染病，临床上主要症状为体温升高、消瘦、淋巴结肿大、皮肤（黏膜、器官）表面广泛性结节及皮肤水肿等。此外，该病毒还可致原发性和继发性肺炎，母牛流产以及公牛暂时或永久不育，对养牛业危害较大，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病[1-2]。

LSD 于1929 年首次在赞比亚被报道，15 年后在博茨瓦纳和南非地区出现。20 世纪70 年代，LSD 向北传播到科尼亚和苏丹，向西传播到尼日利亚，随后相继传播到毛里塔尼亚、马里、加纳和利比里亚等国家。2005 年后，巴林、科威特、阿曼、也门、以色列、黎巴嫩、伊朗、土耳其和约旦河西岸也相继出现疫情。2015 年以来，LSDV 在欧洲东南部迅速蔓延，包括保加利亚、希腊、科索沃、前南斯拉夫马其顿共和国、塞尔维亚和阿尔巴尼亚以及俄罗斯。2019 年8 月，我国首次在新疆地区确诊此病。为加强对其监测与防控，本文对该病及其检测方法行了综述。

1 病原学特征

LSDV 属于痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV），其原型Neethling 毒株最初分离自南非[3]。LSDV 病毒粒子大小约为260～320 nm，有或者无包膜，形态相似，呈砖块状或椭圆形（副痘病毒除外）[4]。该病毒主要通过昆虫（如蚊、蝇和虱）媒介机械传播，其次通过自然接触传播，另外动物唾液污染的饲料和水也可能传播。所有的痘病毒在细胞培养基上生长缓慢，可能需要进行多次传代，其可在牛和羊等多种动物细胞上繁殖，从而引起易于识别的细胞病变效应（cytopathic effects，CPE）[5]。此外，该病毒还可以在鸡胚绒毛膜尿囊膜内繁殖，引起肉眼可见的痘样病变[6]。同时，在被LSDV 感染的家兔中可发现大面积的皮肤损伤。通过对LSDV 感染的单层细胞进行苏木精-伊红染色并借助显微镜，可观察到LSDV 复制发生在宿主细胞内涵体的胞浆内。

LSDV 属于双链DNA 病毒，基因组大小约为151 kbp，由一个具有相同2.4 kbp 反向末端重复序列的中央编码区域和156 个假定基因组成，编码宿主范围、毒力和免疫逃逸的基因位于基因的末端[7]。利用现场样本和疫苗毒株的限制性核酸内切酶对其DNA 进行分析，表明其与羊痘病毒毒株之间的同源性可达80%，且与山羊痘病毒（GTPV）和绵羊痘病毒（SPPV）的基因组核苷酸具有96%的同源性，因此简单的血清学方法很难将其区分[8]。

LSDV 对热敏感，55 ℃条件下2 h 或者65 ℃条件下30 min 便可灭活；耐冻融，在-90 ℃可保存10 年，在受感染的组织液4 ℃可保存6 个月。病毒粒子对酸或碱敏感，可在pH 6.6～8.6 的环境中长期存活；对20%的乙醚、氯仿、1%福尔马林和一些洗涤（如十二烷基磺酸钠剂）敏感。对次氯酸钠（2%～3%）、苯酚（2%，15 min）、碘化合物（1:33稀释液）和季铵化合物（0.5%）等也敏感。此外，该病毒粒子对阳光敏感，在黑暗条件下可保持活力长达几个月[9]。

2 宿主范围

牛和水牛都是LSDV 的自然宿主，其感染率分别为30.8%和1.6%[10-11]。山羊和绵羊被人工接种感染后通常在接种部位局部出现反应，而其他的小型反刍动物未被报道感染LSDV。皮薄高产的奶牛品种对LSDV 高度易感，对于荷斯坦奶牛，高温环境和为了牛奶高产的农业实践操作可能是导致其LSD 严重的原因[12]。然而印度牛和印度牛杂交等品种会对LSDV 有一些自然的抵抗力[13]。截至目前，遗传因素对此病的影响程度还未知。

一般而言，LSDV 具有高度的宿主特异性，主要感染牛和水牛。较少的数据表明野生反刍动物也易于感染LSD，如黑斑羚和长颈鹿接种LSDV 后表现出临床症状。最近，在南非的跳羚皮肤样本中检测到LSDV 核酸[14]。

3 临床症状

LSD 具有急性、亚急性和慢性临床症状，且有40%～50%的受感染动物会出现全身皮肤损伤；许多病例的临床症状并不明显但却可能携带病毒，甚至可以传播病毒。在自然条件下，LSD 的潜伏期是2～4 周，然而在实验条件下所诱导的疾病，潜伏期通常只有4～14 d[2]。这种疾病在哺乳期的奶牛和小牛中，往往更严重[13]。发生临床症状的动物，其发热温度甚至会超过41 ℃，在持续发热的4～14 d，一般会伴随有沮丧、不愿动、食欲不振、流口水、流眼泪和流鼻涕。此外，长期流眼泪可能会引起结膜炎，严重时会引起角膜浑浊和失明。浅表淋巴结，尤其是前脚淋巴结，角前和腮腺通常明显增大[15]。

LSD症状通常发生在发热反应开始后48 h内，其结节数量可能会很多，覆盖全身，也可能只有零星几个，头部、颈部、会阴、生殖器、乳房和四肢等部位的皮肤易发。结节直径范围为5～50 mm，有边界、坚固、圆形和凸起，涉及皮肤、皮下组织，有时甚至会涉及到皮下肌肉。有些小结节可能会自发消退且不留任何痕迹，而有些小结节会引发溃疡，可发生在结膜、口角、鼻孔、口腔黏膜、喉部、气管、食道和皱胃。大结节通常会纤维化且持续数月。一些急性感染可能会发展成严重的部分皮下水肿，如垂皮，胸部、四肢、乳房、阴囊和外阴水肿。水肿四肢的皮肤可能会坏死脱落，出现严重溃疡，进而引起继发性细菌感染；乳房部位的水肿和坏死病变可能会导致乳腺炎；在一些动物体内，气管和肺的坏死病变可能导致肺炎；气管损伤愈合后结缔组织的收缩可能会导致局部气管塌陷，进而导致窒息；公牛通常会暂时不育，也会导致永久不育；怀孕的母牛可能会流产并会持续几个月的不发情期[15-17]。

4 免疫应答

对CaPV 感染的免疫主要是由细胞来介导，需要有效地刺激复制因子[18]。除了被释放到血液中的包膜病毒外，大多数子代病毒仍然留在受感染的细胞内。通过在细胞间传播，这些病毒是循环抗体无法触及和抵抗的。循环的抗痘病毒抗体能够限制病毒在实验动物中的传播，但不能阻止病毒在感染部位的复制。先前感染或接种过疫苗的动物的免疫状况与血清中抗体水平无关。所有CaPV 属的病毒都由一个共同的主要抗原来中和抗体，因此从一种病毒感染中康复的动物被认为至少部分可免受另一种病毒的感染。不论症状是否明显，从LSD 自然感染中康复的动物均会产生抗体，产生的这些抗体能够中和病毒并且对再次感染具有抵抗力[15]。血清中和试验（SNT）、荧光抗体试验（FAT）、间接荧光抗体试验（IFAT）或琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）无法区分CaPVs。血清学交叉感染和交叉保护试验表明痘属病毒具有交叉免疫反应。

5 检测手段

5.1 临床诊断

LSD 可根据特异的临床特征进行诊断，然而当症状不明显时无法进行确诊。由牛疱疹病毒-2（BHV-2）感染、昆虫叮咬、蠕形螨感染、盘尾丝虫病、贝诺孢子虫病和嗜皮菌病引起的皮肤损伤会与LSD 所引起的混淆[19]。一般情况下，BHV-2 感染引起的浅表皮肤病变较多，病程较短，且比LSD 病症轻。此外，病理组织学表明BHV-2感染中存在的核内包涵体与LSD 引起的胞质内的包涵体是相反的。因此，在LSD 病变发生后的一周左右，可通过电子显微镜检测阴性活检标本或分离病毒进行诊断。

5.2 实验室技术

现场作出初步快速诊断确认，是成功控制和根除流行地区和非流行地区LSD 的基础。目前，首选的诊断工具为分子检测方法，且正逐步取代传统的检测方法。传统的血清学检测尽管适用于群体水平，但是对个体水平检测速度慢，结果不可靠，不能作为主要的检测方法。

5.2.1 抗原检测（活的病毒或病毒核酸）

5.2.1.1 PCR 方法 通用的实时定量PCR 方法在检测CaPV 病毒时较其他诊断方法更为敏感。该检测方法主要是检测CaPV 病毒的DNA，因此不能区分同一属的不同品种。RT-PCR 方法已经在很多文献中被报道[20]。采用RT-PCR 方法对CaPV 进行检测，比传统的凝胶PCR 检测方法更为灵敏。该方法的检测水平每次反应均少于10 个基因拷贝，与其他痘病毒无交叉反应，在检测其他痘病毒或者阴性样本时，也未出现假阳性结果。RTPCR 检测方法具有定量、简单、灵敏、特异等特点，可对CaPV 病毒进行快速和高通量的测定。该方法在欧盟相关实验室被广泛使用，如果与自动提取相结合，可用于大规模样本的检测。种特异性RTPCR 方法可区分SPPV、GTPV 和LSDV[14]，该方法通过检测3 种病毒不同的熔点温度差异，对获得的荧光熔融曲线进行分析。聂福平等[21]建立的鉴别检测牛结节性皮肤病病毒野生毒株的RT-PCR 方法，可有效用于临床样品的鉴别检测。与RT-PCR相比，普通PCR 方法速度慢、灵敏度低、操作简单、成本低；但对于某些资源有限以及专业人员缺乏的实验室来说，普通PCR 是较好的选择，只是该方法不能进行定量。近几年逐渐发展起来的便携式现场测试PCR 方法已初步取得较为满意的结果，在现场条件下使用方便，并可在1 h 内获得结果。由于试剂属于冻干状态，所以在现场检测时不需低温操作；样品采集简单方便，无需单独进行DNA 提取，EDTA 中的血液、皮肤损伤部位或所结的痂，唾液、眼睛和鼻子的分泌物均可作为样品材料。

5.2.1.2 环介导等温扩增试验（LAMP）LAMP已经被很多文献报道但是并未广泛使用[22-23]，LAMP 方法的检测结果是通过颜色的改变判定，因此其结果的解释也可能会出现偏差。

5.2.1.3 电子显微镜 通常在1 d 之内便可得到结果，但是电子显微镜技术需要昂贵的设备和专业训练的实验室人员。使用电子显微镜很难区分CaPV 和正痘病毒（Orthopoxvirus），因为二者在形态上比较接近。但是除了牛痘病毒，还没有其他痘病毒可引起绵羊和山羊皮肤损伤。相反，CaPV 与副痘病毒属不同，副痘病毒属可引起牛的流行性口炎，这同样可作为LSD 的鉴别诊断之一[15]。

5.2.1.4 病毒分离 主要用于确认病毒的传染性，并不适合基本诊断，如果有可用的组织培养系统，则可以在多种细胞上进行病毒分离。然而，CaPV在细胞培养上生长缓慢，通常需要进行多次传代。当从皮肤样本或者结痂中分离病毒时，经常会被细菌和真菌污染。

5.2.2 抗体检测

5.2.2.1 血清/病毒中和试验 这是血清学检测的金标准。该方法在检测有轻微临床症状和接种后体内低抗体度的动物还不够敏感，且耗时耗力，因此不适合初步检测或大量样本的检测。中和试验的灵敏度在70%～96%之间，特异性可达100%[24]。但是，作为一种以细胞为基础的检测方法，其标准化相对困难并且其敏感性在不同实验室可能有变化。该检测方法还需要使用活的病毒且必须在具有三级防护水平的实验室进行操作，同时还需有适合细胞培养的材料，如适当的原代细胞或细胞系和参考血清，且样本材料必须是受感染动物的血清。

5.2.2.2 间接荧光抗体试验（IFAT）IFAT 也被用于抗体检测。2008 年，埃塞俄比亚研究人员评估了IFAT 作为诊断工具检测LSD 抗体，测定的容量为每板45 个样品，这比中和试验所检测的样本量大，但是该检测方法可能与其他痘病毒具有交叉反应[24]。由于背景荧光和细胞质的非特异性染色，对IFAT 结果的解释可能更为主观，因此在解释结果前需要进行标准化。

5.2.2.3 琼脂凝胶免疫扩散试验 检测抗体时所需设施简单，操作方便，但敏感度较低并且会与副痘病毒产生交叉反应[25]。实时PCR 方法结合琼脂凝胶电泳可对羊痘病毒进行检测、定量和区分[14]。Zheng 等[26]建立了双重PCR 方法用于同时检测和区分羊痘病毒和口疮病毒，并对其DNA 产物进行凝胶电泳，所建立的方法检出限为1 pfu，且具有较高的灵敏度和特异性。

5.2.2.4 酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA具有敏感性和特异性高的优点，但需注意试剂与仪器的选择，两者会影响其检测结果的准确性。Authie[20]利用ELISA 检测绵羊痘和山羊痘，敏感性为70%～100%，特异性为84%～100%。史宗勇等[27]采用ELISA 方法对山西北部圈养羊群羊痘进行实验室诊断技术研究，检测的12 个样品的OD值孔间变异系数小于10%，说明检测结果稳定性和重复性良好。Babiuk 等[28]采用间接酶联免疫吸附测定法检测山羊、绵羊和牛共231 份血清中羊痘病毒的特异性抗体，结果其敏感性为96%，特异性为95%。同样，Bowden 等[29]采用重组羊痘病毒属抗原建立间接酶联免疫吸附法对病毒进行检测，经过对42 种抗原的筛选，鉴定到有效表达的两个羊痘病毒核心蛋白；当对人工感染病毒的羊血清进行检测，ELISA 的敏感性和特异性范围为95%～97%，且无交叉反应。

6 防控建议

2019 年LSD 已传至我国，对我国养牛业造成了一定打击。为防控LSD 蔓延，政府及有关主管部门应尽早建立LSD 的标准诊断技术，对防疫人员及养殖者开展培训和宣传，建立疫苗储备等。同时，各地方动物疫病预防控制部门应加强LSD 诊断能力和监测排查，在高危和低危地区对易感牛群进行抽样，确保第一时间发现疫情。