凋亡素抗肿瘤的研究进展*

徐少杰，李兴吟，孙 军，袁 萍

华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉 430030

由于肿瘤的遗传多样性和异质性，当前肿瘤的靶向治疗和免疫治疗的效果仍不理想，因此，肿瘤依旧是当今社会威胁人类生命安全最危险的因素之一。凋亡素是一种由鸡贫血病毒(CAV)基因VP3编码而来的非结构性小分子蛋白，通过靶向诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤的功能。近年来，越来越多的科研人员参与到这一领域的研究并进一步阐明了凋亡素抗肿瘤的分子机制。本文将详细综述近年来凋亡素在诱导肿瘤凋亡方面的研究进展。

1 凋亡素概述

CAV是一种单链DNA病毒，属于环病毒属[1]，其基因组包含3个完全或部分重叠的开放阅读框，分别编码VP1、VP2和VP3病毒蛋白，其中VP3病毒蛋白能够激活肿瘤细胞凋亡信号从而诱导凋亡，因此被命名为凋亡素[2-3]。凋亡素是一种14 kD的小分子蛋白，富含丝氨酸和苏氨酸等碱性氨基酸[3]，包括2段核定位信号序列(NLS)和1段核输出信号序列(NES)[4-6]，这些结构域对于凋亡素进行核穿梭运动至关重要。许多研究已经证明凋亡素在肿瘤细胞中能够与多种蛋白相互作用[1]，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤的作用。自20世纪90年代初发现凋亡素以来[7]，由于其具有能够诱导多种人类肿瘤细胞凋亡，而不会对正常细胞产生伤害的特点[8-9]，研究人员希望以此为靶点开发新的、特异性的抗肿瘤治疗方法，这引起了肿瘤研究者的极大兴趣。

2 凋亡素与肿瘤

肿瘤的形成是由于体内外环境刺激而引起的机体遗传物质发生改变并积累的多因素、多阶段的过程，肿瘤细胞通常表现出生长失控、存活率提高、运动能力增强以及代谢模式改变等恶性特征[10-11]。近年来，人们不断探索着抗肿瘤治疗的分子靶标药物和方法，而凋亡素作为一种靶标诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白引起了科研工作者的关注。研究发现，在人类常见的十几种恶性肿瘤中，例如乳腺癌、肝癌、肺癌及胶质瘤，凋亡素都能够有效地发挥抗肿瘤细胞存活的功能[6-7，12]。

2.1 乳腺癌

乳腺癌是当今社会女性群体中最常见的且对生命有严重威胁的恶性肿瘤[13]，尽管近年来在肿瘤的诊疗方面取得了不错的进展，但由于各个地区人类种族、地理环境以及饮食习惯等因素的差异，在全球范围内，仍有许多国家和地区乳腺癌的发病率处于较高的水平[14-15]。Nastasie等[16]的研究发现凋亡素的肿瘤细胞核靶向信号(tNTS)在诱导乳腺肿瘤凋亡的进程中发挥重要作用，首次使用人类乳腺肿瘤进展模型证明凋亡素tNTS在转化细胞的细胞核中累积水平明显提高，并且tNTS序列能够赋予携带该序列的融合组蛋白H3和H2B肿瘤特异性的转导活性，对未来利用蛋白质转导作为基因/药物传递的载体方，这一应用具有重要意义。Hou和Chen等[17-18]的研究表明不管是重组凋亡素蛋白，还是病毒载体表达的凋亡素蛋白，都能够诱导乳腺肿瘤细胞的凋亡，且在这个过程中均表现出时间和剂量依赖性。

2.2 肝癌

原发性肝癌在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食管癌而居第3位，在部分地区的农村中则占第2位，仅次于胃癌[19]。据相关资料统计，肝细胞癌占所有原发性肝癌的90%以上，是一个重大的国际健康问题[19-20]。而凋亡素作为一种潜在的肿瘤治疗靶点，能够有效地诱导肝癌细胞凋亡。综合近年来凋亡素在肝癌方向的研究发现，科研人员希望通过基因载体的方法，在肝癌细胞中诱导凋亡素表达，以研究其对肝癌细胞的影响[21-22]。Bae和Zhang等[9，23]通过病毒或者非病毒基因载体的方法，诱导凋亡素基因在肝癌细胞中表达，结果显示，外源导入的凋亡素能够显著抑制肝癌细胞HepG2的生长，并诱导其凋亡，在裸鼠荷瘤模型中，同样出现了这一现象。

2.3 肺癌

到目前为止，肺癌仍然是世界上肿瘤引起死亡的主要原因之一。由于肺癌在化疗过程中常产生耐药性，极大地限制了化疗的治疗效果，因此，急需寻找一种解决肿瘤细胞化疗过程中产生耐药性的方法[24-25]。Du和Jin等[26-27]发现，将过表达凋亡素的基因治疗载体应用于肺癌细胞中，其能有效抑制肿瘤细胞的生长。联合化疗药物顺铂处理细胞时，具有协同作用，可抑制肿瘤生长，提高模型小鼠的生存率。

2.4 胶质瘤

胶质瘤起源于胶质细胞，是成年人中最常见且最具侵袭性的中枢神经系统肿瘤，其发病率和死亡率表现出逐年上升的趋势，特别是在医疗和卫生水平相对落后的发展中国家[28-29]。近年来，科研人员通过对凋亡素或其衍生物在胶质瘤细胞中功能的研究，希望能探寻一种新的胶质瘤临床应用药物。Song和Bae等[30-31]研究发现，在胶质瘤细胞中，凋亡素及其衍生物能够靶向抑制AKT的磷酸化和基质金属蛋白酶9的表达水平，另外这些成分还能有效激活Caspas-3凋亡信号通路[32]，从而降低肿瘤细胞的增殖能力，提高凋亡率；在原位侵袭性胶质瘤小鼠模型中，凋亡素或者其衍生物在降低肿瘤的生长能力和延长小鼠生存期方面同样发挥着积极作用[30，33]。Zhong和Bae等[33-34]研究者通过表达载体在胶质瘤细胞中诱导凋亡素表达，同样发现其能显著诱导胶质瘤细胞GBL-14和U87MG的凋亡。

以上研究表明，凋亡素是一种有效且广谱的肿瘤细胞杀伤蛋白，在多种肿瘤中能够特异性诱导肿瘤细胞的凋亡。尽管许多实验已经证明凋亡素的肿瘤特异性杀伤效应，但这其中的确切分子机制仍不够清晰。

3 凋亡素的肿瘤特异性核易位

凋亡素是一种能够靶向诱导肿瘤细胞凋亡，而不会对正常细胞产生伤害的小分子量蛋白[7]。临床前动物模型的体内和体外实验也表明，凋亡素具有有效的肿瘤抑制功能，并且表现出极低的生物毒性[3]，这主要是由于凋亡素在诱导肿瘤细胞凋亡的进程中，通常会被肿瘤细胞中相关的信号蛋白激活，导致其在核中积累，而在正常细胞中则停留在细胞质中。阐明凋亡素在肿瘤细胞凋亡进程中与之相互作用的蛋白及其信号转导通路，将有助于凋亡素介导的靶向肿瘤治疗的进展。

3.1 细胞周期检测点激酶1/2(Chk1和Chk2)

在细胞周期的进程中，细胞周期相关蛋白储备和遗传物质的完整性对细胞周期的正常进行至关重要，因此需要每个检查点的“监管者”尽忠职守。在G2/M期的进程中，细胞周期检测点激酶1/2能够精准地检测这一过程中的DNA损伤，发挥其“监管者”的职责，通过阻滞细胞周期进程、DNA损伤修复或者诱导细胞凋亡，维持生物遗传物质的稳定性和细胞生命进程正常进行[35-36]。Kucharski等[8]的研究发现凋亡素能够通过与细胞周期检测点激酶1/2相互作用，导致凋亡素邻近N末端的NES基序的2个苏氨酸残基(T56和T61)发生磷酸化，使其细胞定位发生改变，作为一种DNA损伤信号的“传感器”，引起肿瘤细胞凋亡。又有研究表明肿瘤细胞具有更高的细胞周期检测点激酶活性和较高的DNA损伤修复的信号转导能力[37]。因此，在肿瘤细胞中，通过诱导凋亡素的第56和第61这2个位点的苏氨酸残基磷酸化，能够有效地促进肿瘤细胞凋亡，这为凋亡素选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，且不会对正常细胞产生伤害给出了合理的解释，并为肿瘤的治疗提供了一个具有前景的生物分子靶点。

3.2 蛋白激酶C(PKC)

丝氨酸-苏氨酸激酶家族在细胞周期和分化、形态发生、细胞存活和死亡的过程中发挥一定作用，但是不同家族成员的表达水平以及亚细胞定位各不相同，导致各成员之间的生物学功能差异巨大[38-39]。许多研究表明丝氨酸-苏氨酸激酶家族中的重要成员蛋白激酶C的激活对于诱导细胞活化、增殖、运动和存活是必不可少的[39]。因此在肿瘤研究领域中，蛋白激酶C受到了越来越多的科研工作者的注意。Bullenkamp等[40]的研究发现在结肠癌细胞中，蛋白激酶C的表达水平与凋亡素的活性相关并且二者主要在核中发生相互作用。机制研究表明，在肿瘤细胞中，高水平表达的蛋白激酶CβⅠ作用于凋亡素的苏氨酸残基(T108)，凋亡素NLS基序被磷酸化而与其受体的亲和力增强，导致凋亡素在细胞核中累积，并引起蛋白激酶C的活化，从而激活蛋白激酶CβⅠ介导的凋亡素磷酸化，促进肿瘤特异性的核易位并诱导细胞凋亡，同时发现，由于在正常结肠黏膜细胞中蛋白激酶CβⅠ的表达水平较低，因此上述正反馈通路无法激活，在正常细胞中凋亡素不会引起细胞死亡。Jiang等[41]在多发性骨髓瘤细胞中的研究表明，在众多的蛋白激酶中，只有蛋白激酶Cβ与凋亡素相互作用，并且进一步阐明，通过凋亡素介导的细胞凋亡途径中的蛋白激酶Cβ以蛋白表达水平显著上调的方式诱导细胞凋亡。凋亡素与蛋白激酶Cβ在肿瘤细胞中相互协调诱导肿瘤细胞凋亡的研究，为临床应用凋亡素靶向治疗肿瘤提供了理论支撑。

肿瘤细胞中高表达的Chk1/2和PKC等蛋白作用于凋亡素NES和NLS序列，引起肿瘤细胞的特异性磷酸化水平升高，促使凋亡素核穿梭并定位于细胞核，而在正常细胞中则保持低磷酸化状态，为凋亡素的肿瘤细胞特异性核定位提供了一种新的机制。

4 凋亡素诱导凋亡的信号通路

在肿瘤细胞中，凋亡素被磷酸化，然后易位到细胞核中，并诱导细胞凋亡。然而，与凋亡素结合的异种NLS迫使其进入正常细胞的细胞核并不会导致细胞凋亡率的提升，表明单纯的核定位并不能使凋亡素在正常细胞中诱导细胞死亡[42]。因此，除了核定位外，凋亡素的激活还需要一个或多个额外的事件。阐明凋亡素发挥效应可能的信号通路，是探究凋亡素诱导凋亡全过程必不可少的一部分。

4.1 线粒体凋亡途径

在细胞凋亡进程中，Caspase家族作为关键信号转导分子发挥重要作用，其家族中的一员半胱天冬酶-3是常被激活的细胞凋亡相关蛋白酶，通过催化许多关键蛋白的特异性裂解，在细胞程序性死亡的进程中发挥着重要功能[43-44]。半胱天冬酶-3与凋亡素对细胞命运的影响非常相似，从而引起了科研人员对两者在肿瘤细胞凋亡领域的研究兴趣。先前对凋亡素诱导凋亡的研究方法，通常是将凋亡素通过病毒载体以核苷酸的形式直接转染细胞或者以重组蛋白的形式直接孵育细胞，而在动物模型中则通常将携带凋亡素基因的病毒载体或者重组蛋白直接注射入体内。然而，由于凋亡素半衰期短和细胞或动物模型最大耐受剂量的限制，这些处理方式可能达不到有效浓度或者导致细胞或动物模型发生排斥反应，以致无法得到正确的结论[45-46]。而Du等[26]通过慢病毒表达系统将凋亡素有效地转染间充质干细胞，使其成功合成并分泌凋亡素，诱导肺癌细胞凋亡，并且通过动物模型进一步证实了自主分泌凋亡素的间充质干细胞的抗肿瘤作用。机制研究发现间充质干细胞分泌的凋亡素在肺癌细胞中能够有效地激活半胱天冬酶-3，导致细胞启动凋亡信号。另有研究发现，Apaf-1缺陷的成纤维细胞以及缺乏Apaf-1的肿瘤细胞对凋亡素具有完全抗性，但Caspase-3缺失的MCF-7细胞系依旧被凋亡素杀死[47]，提示凋亡素诱导的死亡涉及Caspase依赖的线粒体通路，但Caspase-3在凋亡素诱导凋亡中不是必要的，可能被Caspase-6或-7等效代替。

在肿瘤细胞凋亡的进程中，凋亡素通过凋亡复合体激活Caspase级联反应，从而诱导肿瘤细胞凋亡，即通过传统内源性途径介导凋亡。

Basse等[48]的研究表明，在宫颈癌细胞系中，抗菌肽(ABPs1)通过与凋亡素联合作用，能够促进半胱天冬酶-3活性水平显著提高，从而激活半胱天冬酶-3介导的细胞凋亡，这些凋亡素发挥抗肿瘤功能的传统机制，在凋亡素与其他凋亡因子联合作用时依旧成立。

4.2 抑制HSP70介导凋亡

热休克蛋白是一类在进化上高度保守的蛋白质，其通过防止蛋白质聚集和促进变性蛋白质重新折叠，抵抗由于理化等体内外环境刺激引起的细胞死亡，Yuan等[49]的研究发现，在肿瘤细胞应激刺激条件下，HSP70首先被激活，凋亡素与细胞质中激活的HSP70结合，并被其转移到细胞核中，在细胞核中，凋亡素促进HSF1三聚体解聚从而抑制HSF1介导的HSP70转录。另外，研究发现HSP70启动子中的HSE能够被凋亡素与HSF1竞争结合，从而导致HSP70的转录水平降低。以上的机制研究清晰地阐述了凋亡素通过抑制HSP70转录起始及蛋白表达水平，从而抵抗HSP70介导的肿瘤凋亡保护的能力。而Song等[30]的研究发现，不仅凋亡素能够结合HSP70启动子中HSE的SH3功能域，凋亡素来源的微肽也同样具有此功能，进而抑制HSP70的转录和表达。

HSP70是其中一种广泛参与抑制线粒体凋亡通路和膜受体凋亡通路的抗凋亡蛋白[50-51]，通过结合细胞色素c或Apaf-1抑制凋亡复合体的形成和对Caspase-3的募集[52]，从而对细胞凋亡起到抑制作用。推测凋亡素通过靶向抑制HSP70的活性，抑制肿瘤自我保护的能力，从而诱导肿瘤细胞凋亡。恶性细胞比正常细胞表达更高水平的HSP70[51]，也可以解释凋亡素介导肿瘤细胞凋亡的特异性。

5 总结与展望

自凋亡素发现以来，研究人员为探索其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制而不断努力。从当前的研究分析，我们发现不仅凋亡素蛋白的C端或N端位置的NLS和NES控制着其肿瘤细胞特异性的定位和核穿梭[8，53]，而且不同蛋白质与其相互作用，同样影响到凋亡素的定位[4，54]。在细胞核中凋亡素的异常积累，通常激活线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路，诱导多种肿瘤细胞凋亡[55-56]。

近年来，研究人员初步阐明了凋亡素发挥功能的分子作用机制，这为其在肿瘤诊疗中的应用奠定了理论基础。到目前为止，已经发现在多达十几种肿瘤中，凋亡素与相关蛋白作用能够有效诱导凋亡进程的发生，引起肿瘤细胞死亡[1，7]。凋亡素的细胞毒性机制与其亚细胞定位存在极大的关系，从而发挥选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，此种特性使其成为肿瘤治疗领域的良好“候选物”。

尽管凋亡素在肿瘤治疗领域的研究已经有很多年的历史，并且取得了一定成果。然而，凋亡素诱导肿瘤细胞死亡的确切机制尚不清楚，正常细胞中何种物质阻断了凋亡素的信号转导?在肿瘤细胞中是否存在阻断凋亡素入核或在核中积累的物质？这一系列问题仍需要我们不断探索。以凋亡素为导向的抗肿瘤药物或生物分子仍未开发出来，作为临床一线治疗药物的应用，还有很长的路要走。