离子色谱法测定生鲜牛奶中硫氰酸钠前处理方法的研究

黄惠雯

(广西壮族自治区兽药监察所, 南宁 530001)

硫氰酸钠是白色斜方晶系结晶或粉末,在空气中易潮解,遇酸产生有毒气体,易溶于水,乙醇,丙酮等溶剂。 生鲜牛奶中掺入硫氰酸钠可有效抑菌,增加保鲜时长,但硫氰酸钠是毒害品,少量食入就会对人体造成极大伤害。 硫氰酸钠的毒性主要由其在体内释放氰根离子,氰根离子在体内能很快与细胞色素氧化酶中的三价铁离子结合,抑制该酶活性,使组织不能利用氧而产生中毒。 饮用含有过量硫氰酸钠的牛奶会对人体造成恶心、呕吐、腹痛、胃肠道功能紊乱等不利影响,硫氰酸钠在牛奶中属于违禁添加物。 目前我国对生鲜牛奶中硫氰酸钠含量的监测主要采用的是MRT/B 8-2016《生乳中硫氰酸钠的测定 离子色谱法》,该方法具有灵敏度高,分离效果好的特点,但方法中采用有机试剂乙腈为样品前处理蛋白质沉淀试剂,乙腈具有毒性大,易挥发,对身体有一定的危害性,严重者可致呼吸及循环系统紊乱,阵发性抽搐、昏迷等。 本文以探寻低毒、安全的前处理试剂以及性价比高的固相萃取小柱为目的,对离子色谱法测定生鲜牛奶中的硫氰酸钠前处理方法进行优化对比。

生鲜牛奶含有丰富的矿物质,种类复杂。 主要成份有水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等。 选择优质的固相萃取柱可对样品进行选择性吸附、洗脱、富集、分离、净化,能很好的去除生鲜牛奶中的杂质,保护色谱柱,并减少对主目标色谱峰的检测干扰。 因此去除生鲜牛奶中的蛋白质等一些有机物质是保护色谱柱、延长使用寿命的关键。 蛋白质的沉淀是从溶液中由液相变成固相析出的过程,常用的蛋白质沉淀方法有盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、生物碱试剂沉淀法等。 本实验主要考察了有机溶剂沉淀法中的五种蛋白沉淀剂,分别是甲醇、乙醇、乙腈、乙腈+1%乙酸锌、乙腈+5%乙酸锌,通过加标回收的方式进行筛选,以便筛选出最忧的沉淀剂。 同时主要考察了C18、MCX、PCX、HLB、RP 5种不同填料的固相萃取柱对生鲜牛奶样品进行添加适量的硫氰酸根标准溶液后提取净化,计算回收率,从而选出最佳的固相萃取柱。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ICS900 离子色谱仪(配有淋洗液自动电解发生器,电导检测器和ASRS 500 型4mm 抑制器,美国戴安公司);电子天平(德国赛多利士公司);高速冷冻离心机(sigma);C18 固相萃取柱(3cc);HLB 固相萃取柱(3cc);MCX 固相萃取柱(3cc);PCX-SPE 固相萃取柱(3mL);RP 小柱(2.5mL);1000μg/mL 硫氰酸根标准溶液(O2Si 公司);甲醇、乙醇、乙腈和乙酸锌(分析纯);去离子水(电阻率为18.25MΩ/cm);0.22μm 有机相滤膜(津腾)。

1.2 色谱条件

45mmol/L 和60mmol/L 氢氧化钾溶液作为流动相梯度洗脱, IonPac AS-16 型色谱柱(4mm*250mm)和IonPac AG-16 型保护柱(4mm*50mm)分析,柱温30.0℃,流速1.0mL/min。

1.3 蛋白质沉淀剂的优化方法

称取4g(精确至0.01)生鲜牛奶样品置于50mL离心管中,分别用五种蛋白沉淀剂溶液定容至10mL,涡旋1min,静置沉降蛋白20min,以9500r/min,4℃离心5min。 取出全部上清液,过0.22μm 有机相滤膜,收集滤液供离子色谱仪测定,同时做空白、添加试验。

1.4 固相萃取柱的优化方法

将C18、MCX、PCX、HLB 和RP 小柱依次用5mL甲醇、10mL 去离子水活化后待用。 利用乙腈沉淀蛋白的生鲜牛奶样品得到的上清液,过0.22μm 有机相滤膜后,分别注入以上小柱中,弃去前2mL 段滤液,以小于3mL/min 的流速通过。 收集滤液供离子色谱仪测定硫氰酸根浓度,从而计算出生鲜牛奶中硫氰酸钠含量,同时做空白、添加试验。

2 结果

2.1 硫酸氢根标准曲线方程

将硫氰酸根标准溶液,准确配制成0.01、0.02、0.10、0.50、1.00 和5.00mg/L 的硫氰酸根标准工作液进行测定。 以峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线见图1、图2。

图2 表明,硫氰酸根标准溶液在质量浓度0.01～5.00mg/L 范围内线性良好,该标准曲线的回归方程为y=0.4840x-0.0124,R2 为0.9995。

图1 硫氰酸根标准曲线色谱图

图2 硫氰酸钠标准曲线

2.2 不同类型沉淀剂对蛋白沉淀效果的影响

实验表明,生鲜牛奶样品加入五种不同的蛋白质沉淀剂,样品未离心前均出现有不同程度的浑浊凝固状态,静置沉降蛋白20min 后,肉眼观察,乙腈+5%乙酸锌的沉淀效果相对较好,样品中蛋白均沉降于底部,上层呈现澄清状态。 再经过4℃9500r/min高速冷冻离心后,五种沉淀剂均获得了澄清状态的样品液(见表1)。

表1 不同类型沉淀剂对生鲜牛奶沉淀蛋白的效果

2.3 不同类型沉淀剂对硫氰酸钠回收率的影响

生鲜牛奶样品经过不同类型蛋白质沉淀剂沉淀蛋白质后,加入适量的硫氰酸钠标准溶液提取回收计算后得出,乙腈提取效果最好,回收率为98.2%。但是使用乙醇作为蛋白沉淀剂不仅可以有效的去除生鲜牛奶样品中的蛋白质,获得96.1%相对较好回收率,而且具有毒性低,试剂相对安全,价格便宜的优势,乙醇可选择适用于生鲜牛奶沉淀蛋白质步骤中最佳的蛋白质沉淀剂试(见表2)。

表2 不同类型沉淀剂对硫氰酸钠回收率的影响

2.4 不同固相萃取小柱净化对硫氰酸钠回收率的影响

固相萃取小柱优化比对实验中,通过样品实验加标计算回收率可得出,五种固相萃取柱出峰时间相对固定,周围不存在杂质峰的干扰,且回收率均大于80%。 其中使用HLB 及C18 固相萃取小柱的样品均获得了较好的回收率。 由于未使用前处理小柱过柱的样品中含量一定的有机物质,出于对色谱柱的保护,不建议采取未过前处理小柱的方式直接上机。 硫氰酸根为带电荷的强极性阴离子,HLB 固相萃取柱是利用反相吸附洗脱的原理,作用与C18 固相萃取柱相似,但其拥有高吸附容量,与硅胶相比,吸附剂的表面积增大2 ～3 倍。 结果表明,HLB 固相萃取小柱去除有机物质,性价比最佳(见表3,图3～7)。

表3 不同固相萃取柱净化对硫氰酸钠回收率的影响

图3 HLB 固相萃取小柱色谱图

图4 PCX 固相萃取小柱色谱图

图5 MCX 固相萃取小柱色谱图

图6 C18 固相萃取小柱色谱图

图7 RP 固相萃取小柱色谱图

3 结论与分析

本试验建立在《MRT/B 8-2016 生乳中硫氰酸根的测定离子色谱法》测定生乳中硫氰酸钠含量的前提下,对前处理操作中蛋白质沉淀剂及固相萃取小柱进行实验优化对比,目的是为了得到了更高效、更安全、性价比最佳的操作方法。 实验样品分析表明,采用有机溶剂法能快速沉淀生鲜牛奶中的蛋白质,乙醇在对比实验中净化效果好、回收率高,且试剂低毒,性价比高的特点。 HLB 固相萃取小柱是酸性,中性和碱性化合物的通用性吸附剂,能净化,提取和浓缩样品中的杂质物,回收率高而稳定的特点,即使柱床干涸,回收率也不受影响,HLB 固相萃取小柱在对比实验中,得到了较高的回收率,对氨基酸、脂肪等杂质有明显的吸附作用,能减少主目标物硫氰酸钠的检测干扰。 经本实验表明,采用乙醇作为蛋白质沉淀剂及HLB 固相萃取小柱作为生鲜牛奶中测定硫氰酸钠的前处理方法,操作简单,性价比高,试剂安全低毒,为生鲜牛奶质量监控提供了可靠依据。