响应面法优化航天杂交构树叶总黄酮提取工艺及体外抗弧菌活性研究

张志鹏， 蔡延渠， 梁炜祺， 董碧莲， 吴燕红， 陈必添， 冯华仔

（1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100；2.广东药科大学新药研发中心，广东广州 510006；3.阳江市金星种养产业研究院，广东阳江 529500）

构树（Broussonetia papyrifera L.vent）为桑科构树属的多年生落叶阔叶乔木，又名楮树。航天杂交构树是中国科学院植物研究所利用现代生物技术和传统杂交育种方法，采取基因工程、新种质创制和航天搭载诱变等技术而培育出的多功能林木树种[1]。“构树扶贫工程”被列入2015年国家十大精准扶贫工程之一。

传统中医认为，构树的乳液、根皮、树皮、叶、果实及种子均可入药，具有祛风、利尿、凉血、杀虫解毒等功效；现代研究[2]表明，构树具有抗真菌、抗氧化、抗血小板、抗肝细胞毒、酪氨酸酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制等生物活性，可用于治疗真菌感染、癌症、糖尿病等疾病，主要与构树中的黄酮类成分密切相关。

弧菌病是水产养殖动物的常见疾病，引发的致病菌株主要有副溶血弧菌（V.prarhaemolyticus）、创伤弧菌（V.vulnificus）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、鳗弧菌（V.anguillarium）和非01霍乱弧菌（V.cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等[3]；同时抗生素的乱用、滥用，导致耐药性及水体残留量日益严重，影响了水产养殖业的可持续发展和绿色健康发展。黄酮类成分作为构树的主要组成，目前在抗菌方面仅有抗镰孢霉菌真菌[4]的活性报道。因此，本研究以航天杂交构树叶为原料制备总黄酮，采用加热回流提取法，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken响应面法进行工艺优化；同时以抑菌圈直径、最低抑菌浓度评价总黄酮提取物及其不同溶剂萃取物在体外抗常见致病弧菌的活性，为构树叶总黄酮及其活性成分的开发利用提供实验依据，亦为航天杂交构树品种的种植推广提供新动力，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 药材 航天杂交构树叶样品由阳江市金星种养产业研究院提供，经广东药科大学新药研发中心吴燕红高级工程师鉴定为桑科构树属构树（Broussonetia papyrifera L.vent）的叶。

1.2 菌株 哈维弧菌（ATCC 33842）、副溶血弧菌（ATCC 17802-G1）、溶藻弧菌（ATCC 33787），由中国水产科学院研究院南海水产研究所提供；创伤弧菌（ATCC 27562）、非 01霍乱弧菌（GIM 1.449）、嗜水气单胞菌（ATCC 35654），由广东省微生物菌种保藏中心提供。

1.3 试剂 95%乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；2216E琼脂培养基、2216E液体培养基、营养琼脂培养基、LB液体培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。

1.4 仪器 UV-1700双光束紫外分光光度计（日本岛津公司）；EPED-10TF纯水器（南京益普易达科技发展有限公司）；SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；DHP-9082恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；DHG-9140电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LX-B50L立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；JJ1000Y电子天平（美国双杰集团有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BHS-4数显恒温水浴锅（江阴市保利科研器械有限公司）。

2 方法与结果

2.1 航天杂交构树叶总黄酮测定[5]

2.1.1 总黄酮样品溶液制备 称取干燥的航天杂交构树叶粗粉约30 g，按料液比1∶20[（m/g）∶（V/mL），下同]加入体积分数50%乙醇，100℃加热回流提取2次，1.5 h/次，趁热过滤，滤液75℃减压浓缩至适量，定容成1 g（生药）/mL。吸取0.1 mL该药液至10 mL容量瓶中，加入适量体积分数80%乙醇超声5 min，定容，即得样品溶液。

2.1.2 标准曲线绘制 称取一定量的芦丁对照品于10 mL容量瓶中，加入体积分数80%乙醇制备成质量浓度为1.160 mg/mL的标准溶液。分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL标准溶液于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，室温静置6 min；再加入5%Al（NO3）3溶液1.0 mL，室温静置6 min；再加入5%NaOH溶液2.5 mL，用体积分数80%乙醇定容，摇匀后放置15 min。以体积分数80%乙醇为空白参照，在500 nm处测定吸光度（D）值。以吸光度D值为纵坐标（Y）、芦丁质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程，Y＝10.994 5X-0.145 0，r＝0.997 7。结果显示在0.023 2～0.092 8 mg/mL范围内呈现良好线性关系。

2.1.3 精密度试验 准确吸取0.5 mL质量浓度为1.160 mg/mL的标准溶液，平行6份，按“2.1.2”项下操作进行络合反应后测定吸光度D值，计算得平均值为0.457，相对标准偏差（RSD，sR）=0.83%，结果表明仪器的精密性良好。

2.1.4 重复性试验 准确吸取1.0 mL“2.1.1”项下的总黄酮样品溶液，平行6份，按“2.1.2”项下操作进行络合反应后测定吸光度D值，计算得平均值为0.420，sR=0.86%，结果表明该法的重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 准确吸取1.0 mL“2.1.1”项下的总黄酮样品溶液，平行3份，按“2.1.2”项下操作进行络合反应。3 h内每隔0.5 h测定吸光度D值，计算得平均值为0.415，sR=1.29%，结果表明该样品溶液在3 h内显色反应稳定。

2.1.6 加样回收率试验 准确吸取0.7 mL“2.1.1”项下已知质量分数的总黄酮样品溶液，平行6份，分别加入0.3 mL质量浓度为1.160 mg/mL的标准溶液，按“2.1.2”项下操作反应。测定吸光度D值，计算平均回收率为97.33%，sR为1.37%，结果表明该法的准确性良好。

2.1.7 航天杂交构树叶总黄酮得率测定 吸取航天杂交构树叶总黄酮溶液1.0 mL，按“2.1.2”项下操作进行反应后测定吸光度D值，代入回归方程计算总黄酮质量。按以下公式计算其得率：航天表示总黄酮质量（g），M表示航天杂交构树叶质量（g）。

2.2 单因素实验

2.2.1 不同乙醇浓度考察 称取航天杂交构树叶粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20分别加入体积分数40%、50%、60%、70%、80%乙醇，100℃加热回流提取2次，2 h/次。结果显示，乙醇浓度为40%～70%时，随着乙醇浓度的升高，总黄酮的溶出明显增加，之后即使乙醇浓度增加，总黄酮得率仅略微提高。结果见图1。

图1 不同乙醇浓度对航天杂交构树叶总黄酮得率的影响（n=3）Figure 1 Effects of different ethanol concentrations onthe yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.2 不同提取温度考察 称取航天杂交构树叶粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入体积分数70%乙醇，于60、70、80、90、100℃加热回流提取2次，2 h/次。结果显示，随着温度的升高，总黄酮的溶出明显增加，当温度升至100℃时，得率最高。结果见图2。

2.2.3 不同料液比考察 称取航天杂交构树叶粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入体积分数70%乙醇，100℃加热回流提取1次，2 h/次。结果显示，料液比在1∶10～1∶20间，随着溶剂用量的增大，总黄酮的溶出明显增多，之后即使加大溶剂量，得率仅略微提高。结果见图3。

图2 不同提取温度对航天杂交构树叶总黄酮得率的影响（n=3）Figure 2 Effects of different extraction temperatures on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

图3 不同料液比对航天杂交构树叶总黄酮得率的影响（n=3）Figure 3 Effects of different solid-liquid ratios on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.4 不同提取时间考察 称取航天杂交构树叶粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入体积分数70%乙醇，100℃加热回流提取1次，0.5、1、2、3、4 h/次。结果显示，随着提取时间的延长，总黄酮含量随着提高。在提取时间为0.5～2 h时，含量提高明显；但在2～4 h内，增幅不明显。结果见图4。

图4 不同提取时间对航天杂交构树叶总黄酮得率的影响（n=3）Figure 4 Effects of different extraction time on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.2.5 不同提取次数考察 称取航天杂交构树叶粗粉20 g，平行3份，按料液比1∶20加入体积分数70%乙醇，100℃加热回流提取1、2、3、4次，2 h/次。结果显示，增加提取次数能够明显提高总黄酮含量，但是提取2次后，药物已基本溶出完全。结果见图5。

图5 不同提取次数对航天杂交构树叶总黄酮得率的影响（n=3）Figure 5 Effects of different extraction times on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves（n=3）

2.3 Box-Behnken响应面法优化[6-7]通过单因素试验，选择乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D），以总黄酮得率为评价指标，采用软件Design-Expert 8.0进行4因素4水平Box-Behnken响应面试验设计。因素水平见表1，结果见表2。

表1 响应面法因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology test

通过对数据进行多元回归拟合，得到航天杂交构树叶总黄酮得率（Y）对4因素的回归方程：Y=5.93+0.65A+0.29B+0.34C+1.28D-0.035AB+0.15AC+0.19AD+0.027BC+0.18BD+0.040CD-0.70A2-0.35B2-0.62C2-1.05D2。

2.3.1 回归模型与方差分析 表3结果显示，模型F值为32.74（P＜0.000 1），表明具有显著性差异；同时失拟项值为3.44（P＞0.05），表明拟合度良好。相关系数R2为0.970 4及失拟项系数R2Adj为0.940 7，均表明模型预测值与实测值的相关性良好。由F值可知，因素A、B、C、D对航天杂交构树叶总黄酮得率具有显著性影响（P＜0.01），顺序依次为A=D＞C＞B，但其相互间的交互项影响差异不显著（P＞0.05），表明航天杂交构树叶总黄酮与各个因子之间不单单是线性关系。二次项A2、B2、C2、D2影响显著（均P ＜ 0.01）。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Regression analysis results of variance analysis

2.3.2 响应面图分析 通过模型绘制各因素的等高线与响应面，分析结果可知，料液比与提取时间、提取次数三者间两两的响应面较为陡峭、等高线较为趋于椭圆形，表明因素间交互作用较为显著。结果见图6。

2.3.3 验证试验 由软件分析所得的航天杂交构树叶总黄酮最优提取工艺条件：乙醇浓度68.88%、料液比1∶20.09、提取时间1.99 h、提取2.48次，预测得率为6.21%。结合实际操作，确定最终优化方案：乙醇浓度70%、料液比1∶20、提取时间2 h、提取3次。重复3次试验，总黄酮得率为（6.02±0.14）%，比预测值低了0.19%。表明该模型具有较好的预测性，优化所得工艺稳定可行。

2.4 航天杂交构树叶总黄酮抗弧菌活性测定[8-9]

2.4.1 药物制备 称取航天杂交构树叶粗粉200 g，按照最优工艺：乙醇浓度70%、料液比1∶20、提取时间2 h、提取3次，减压浓缩至适量，平均分成两份，进行不同处理：（1）将溶液进一步浓缩，定容成1 g（生药）/mL的原药液；（2）将药液依次采用极性由低到高的有机溶剂进行萃取，即得不同部位的萃取物（石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层），以1%二甲基亚砜溶液定容成1 g（生药）/mL的药液。

2.4.2 菌种复苏及培养 将保存于-70℃的哈维弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、非01霍乱弧菌、嗜水气单胞菌菌种取出，分别以接种环于2216E琼脂板上划线，37℃复苏20 h。挑选形态良好的单菌落，于2216E液体培养基中37℃振荡培养6 h，采用麦氏比浊管校正，最终稀释成菌落数浓度为1×106CFU/mL的菌悬液。

2.4.3 抑菌圈直径测定 采用K-B纸片法，先吸取1 g（生药）/mL的原药液及不同部位萃取物药液各20μL于直径7 mm的纸片上，50℃烘干，即得药敏片。再吸取0.2 mL菌悬液于2216E琼脂板上，涂匀，稍晾干，将各药敏片等距离贴放于菌板表面，倒置于恒温培养箱中37℃培养20 h，取出用游标卡尺测量抑菌圈直径，重复3次试验。结果判读：抑菌圈直径＜7 mm为不敏感，7～12 mm为低度敏感，12～17 mm为中度敏感，＞17 mm为高度敏感。

图6 不同因素交互作用对航天杂交构树叶总黄酮得率影响的响应面与等高线图Figure 6 Contour and response surface plots for the correlative effects of different factors on the yield rate of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia papyrifera leaves

分析表4结果可知，以生药量计，航天杂交构树叶总黄酮提取物的对弧菌的敏感度比各部位萃取物更强，对哈维弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌表现出高度敏感，对溶藻弧菌、非01霍乱弧菌则表现出中度敏感。同时，经过不同极性有机溶剂萃取，活性物质主要集中于乙酸乙酯层和水层，其次是石油醚层，最弱的是二氯甲烷层和正丁醇层。

2.4.4 最低抑菌浓度（MIC）测定 采用微量稀释法，将原药液及不同部位萃取物药液按倍比进行稀释成系列浓度（0.98～1 000 mg/mL），分别吸取药液及菌悬液各100μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶剂和菌悬液各100μL作阴性对照，置恒温培养箱中37℃培养20 h。结果判读：肉眼观察，药物最低浓度孔无细菌生长者，即为该试菌MIC值。难判断者，可将该孔中培养液于无菌琼脂板上划线，37℃培养20 h后读取结果。

分析表5结果可知，航天杂交构树叶总黄酮提取物抗弧菌活性较不同有机溶剂萃取物更强，其中对嗜水气单胞菌最强，其次是副溶血弧菌，接着是哈维弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌，最弱的是非01霍乱弧菌。对于不同部位萃取物，以乙酸乙酯层及水层的活性最强，其次是石油醚层、正丁醇层，二氯甲烷层基本无抗弧菌活性。

表4 航天杂交构树叶对不同弧菌的抑菌圈直径Table 4 The diameters of inhibition zone of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia Papyrifera leaves on different vibrios （-x±s，d/mm）

表5 航天杂交构树叶对不同弧菌的MIC值Table 5 The minimal inhibitory concentration of total flavonoids from spaceflight hybrid Broussonetia Papyrifera leaves on different vibrios[ρ/（mg·mL-1）]

3 讨论

本研究采用Box-Behnken响应面法优选出航天杂交构树叶总黄酮的最佳提取工艺：乙醇浓度70%、料液比1∶20、2 h/次、100℃加热回流提取3次。验证结果显示总黄酮得率与预测值接近，表明本模型所优选出的工艺稳定可行。

体外抗菌活性结果显示，抑菌圈直径与最低抑菌浓度之间具有正相关性，即抑菌圈直径越大、MIC值则越低。表明航天杂交构树叶总黄酮提取物具有较明显的抗弧菌活性，强弱顺序依次为嗜水气单胞菌＞副溶血弧菌＞哈维弧菌=溶藻弧菌=创伤弧菌＞非01霍乱弧菌。通过采用不同极性的有机溶剂纯化，发现活性物质主要集中于乙酸乙酯层及萃取后的水层，表明航天杂交构树叶总黄酮提取物的抗菌活性是由不同极性成分间协同作用的结果。

因此，航天杂交构树叶总黄酮可作为新的抗感染药物尝试防治水产养殖常见病害—弧菌病，不仅有利于提高种植户种植航天杂交构树的经济效益及降低养殖户因弧菌病害而引起的经济损失，而且能够进一步实现无抗或抵抗养殖、创造绿色健康食品的良好社会效益。