不同花色福鼎白茶中挥发性萜类化合物的对映异构体分布

严 寒，朱 荫*，穆 兵，吕海鹏，KANG Suyoung，张 悦，林 智*

（1.农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

挥发性萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生、分子骨架以异戊二烯单元（C5单元）为基本结构单元的化合物及其衍生物，包含单萜、倍半萜等，往往具有较低的香气阈值和宜人的香气，广泛存在于植物源性食品中[1]。挥发性萜类化合物大多具有1 个或多个手性碳原子，存在香气特性及香气阈值均可能迥异的对映异构体，如S-芳芳醇呈现甜香及花香（香气阈值7.4 μg/L）[2]，R-芳芳醇呈木香（香气阈值0.8 μg/L）[3]；(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2R,5S)-芳芳醇氧化物B具有青叶香及泥土香，(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、(2S,5R)-芳芳醇氧化物B、(2S,5R)-芳芳醇氧化物C及(2S,5S)-芳芳醇氧化物D具有甜香、花香及奶油香，(2R,5S)-芳芳醇氧化物C及(2R,5R)-芳芳醇氧化物D则具有泥土气息等[4]。自然界中萜类化合物往往以不同比例的对映异构混合体形式存在于生命体或食品中，不同比例的混合形式导致了植物或食品繁多复杂的风味特性，尤其同一产地或品种来源的食品或植物中的部分萜类化合物具有高度一致性和特异性[5-7]。据此，萜类化合物的手性分布特性引起了食品科学领域的广泛关注，萜类化合物的对映异构体分析已被初步应用于植物及风味食品的产地判别、品种溯源及真伪鉴别等方面[8-10]。

挥发性萜类化合物是茶叶香气的重要组成，对茶叶优良香气品质的形成起着举足轻重的作用[11]。目前，挥发性萜类化合物的对映异构体研究在茶叶领域仍处于初步发展阶段，仅有少数相关研究报道[4,12-17]。近期，本研究组建立了茶叶中15 种重要萜类化合物（包括芳芳醇、芳芳醇氧化物A～D、橙花叔醇、柠檬烯、α-松油醇、4-萜品醇、香香醇、α-紫罗兰酮及茶螺烷等）的对映异构体分析方法，结果表明其对映异构体比例（enantiomeric ratio，ER）值及其含量在45 个市售的代表性茶样中存在显著性差异，且它们的对映异构体分布特征与茶树品种、产地及加工工艺存在密切联系[14-17]。由此可见，挥发性萜类化合物的对映异构体分布在茶叶真伪辨析及指纹图谱构建等方面展现出较大的潜力。然而，目前鲜见针对具体茶类中挥发性萜类化合物对映异构体分布特征的系统研究报道，这也限制了手性分析技术在茶叶质量控制领域的进一步深入。

白茶是我国传统六大茶类之一，产区有福鼎、政和、松溪和建阳等县，其中产于“中国白茶之乡”福鼎的福鼎白茶是白茶的典型代表[18]。根据其采摘标准及制茶原料的区别，可将福鼎白茶划分为白毫银针、白牡丹、寿眉和贡眉4 种花色[19]，它们的风味品质各俱特色，受到不同消费群体的喜爱与关注。目前，白茶的品质化学成分差异性分析已有较多的研究报道[20-24]，然而白茶中挥发性成分的对映异构体分布情况尚未明了，因此白茶中手性挥发性萜类化合物的研究具有较高的研究价值和理论意义。本研究拟在前期工作的基础上，采用顶空固相微萃取（headspace-solid-phase microextraction，HSSPME）法结合手性气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用技术对不同花色福鼎白茶的香气成分进行分析，旨在填补手性分析在白茶品质化学上的研究空白，分析挥发性萜类化合物在不同花色福鼎白茶中的对映异构体分布特征，为今后白茶指纹图谱构建及香气品质形成机理研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白茶样品于当地市场采集或由合作厂家直接提供，并根据GB/T 22291—2017《白茶》筛选出具有代表性香气品质的不同花色福鼎白茶共计11 个。其中白毫银针样品4 个，分别为福建品品香茶业有限公司提供的BHYZ-1及BHYZ-2，福建省天湖茶业有限公司提供的BHYZ-3以及福建鼎白茶业有限公司提供的BHYZ-4；白牡丹样品3 个（BMD-1、BMD-2、BMD-3），均由福建誉达茶业有限公司提供；寿眉样品4 个（SM-1、SM-2、SM-3、SM-4），其中SM-2由福鼎市天毫茶业有限公司提供，其余3 个样品均由福建鼎白茶业有限公司提供。

挥发性萜类化合物标准品（15 种萜类化合物的消旋体及对映异构体）：(±)-α-蒎烯、R-α-蒎烯、S-α-蒎烯、(±)-芳芳醇、(±)-香香醇、S-香香醇、(±)-α-紫罗兰酮、无水乙醇、反式-橙花叔醇（均为色谱级） 北京百灵威（J&K）科技有限公司；R-柠檬烯、S-柠檬烯、芳芳醇氧化物（呋喃型）、(±)-4-萜品醇、R-4-萜品醇（均为色谱级） 上海TCI公司；R-芳芳醇、(±)-茶螺烷、S-α-松油醇、顺式-橙花叔醇（均为色谱级） 美国Sigma-Aldrich公司；(±)-α-松油醇（色谱级） 上海Aladdin公司；茉莉酸甲酯（色谱级） 日本Wako公司；氯化钠（分析级） 北京普益华科技有限公司；纯净水 杭州娃哈哈集团。

1.2 仪器与设备

密封萃取瓶 自制；手动SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂层纤维萃取头、Astec CHIRAL DEX B-DM色谱柱（30 m×0.25 mm，0.12 μm） 美国Supelco公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；DK-S22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；SQP型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；S025 Tube Mill C控制型试管研磨机 艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取茶粉1.00 g，加入到自制的改良萃取瓶中并充分混合，加入5 mL沸水冲泡，立刻旋盖，放入50 ℃水浴锅平衡3 min，然后插入装有已老化过的DVB/CAR/PDMS萃取头的手动进样器，在水浴条件下顶空萃取30 min，萃取时间到达后取出并立即插入GC进样口中，解吸附5 min，回集数据。每个样品平行重复3 次。

1.3.2 色谱条件

GC条件：Astec CHIRAL DEX B-DM色谱柱（30 m×0.25 mm，0.12 μm）；进样口温度250 ℃；分流进样，分流比1 0∶1；载气：高纯氦气（纯度≥99.99%），柱流速1.0 mL/min；升温程序：初始柱温50 ℃，保持2 min，再以2 ℃/min升温至150 ℃，保持10 min，最后以4 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min。

1.3.3 MS条件

电子电离源；电离能量-70 eV；离子源温度220 ℃；四极杆温度150 ℃；运行全扫描模式；质谱传输线温度250 ℃，质量扫描范围30～600 u；溶剂延迟5 min。

样品前处理方法及GC-MS分析方法均在本研究组已采用的提取方法[17]基础上进行微调。

1.3.4 感官审评

参照GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》，委托茶叶感官审评专家对11 个不同花色福鼎白茶进行感官审评，针对茶叶的外形、汤色、香气、滋味及叶底5项因子进行百分制评分，茶样各因子的评分乘以相应评分系数并累加即得该茶样的审评总分。

1.3.5 白茶中挥发性萜类化合物对映异构体的定性定量分析

定性分析通过比对各标准品的保留时间及质谱的特征峰离子；相对定量分析采用峰面积归一化法计算获得，仅计算各对映异构体在所有目标萜类化合物所占比例，按式（1）计算：

式中：C1为某挥发萜类化合物对映异构体的相对含量/%；A1为该对映异构体的定量离子峰面积；A总为可定性出的所有挥发性萜类化合物的峰面积总和。

采用ER值[25]描述白茶中挥发性萜类化合物对映异构体分布情况。按式（2）～（4）计算：

式中：ER直接以比值形式呈现（不计算具体数值，E1+E2=100）；A1和A2分别为某挥发性萜类化合物的一对对映异构体的定量离子峰面积。

1.4 数据多元统计分析

采用Excel 2010（美国Microsoft公司）对原始数据进行标准化处理，并绘制柱状图；偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）采用SIMCA-P 12.0软件（瑞典Umetrics公司）完成；非参数检验采用SPSS Statistics 20软件完成（美国IBM公司）；层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）使用MeV生物信息学分析软件（美国Oracle公司）完成。

2 结果与分析

2.1 感官审评结果

表1 福鼎白茶的感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of different types of Fuding white teas

本研究所选用的11 个福鼎白茶均产自福建福鼎市，鲜叶原料为福鼎大白茶或福鼎大毫品种，采用传统白茶工艺（采摘、萎调、干燥、拣剔）加工而成，其中白毫银针的采摘标准为单芽，白牡丹采摘标准为一芽一、二叶，寿眉采摘标准为嫩梢或叶片。如表1所示，白毫银针样品的感官特征主要是“外形披毫，汤色杏黄，香气清甜带毫香，滋味清甜，叶底匀整、肥壮、软嫩”，总分均在90以上；白牡丹样品的感官特征主要是“外形灰绿显毫、尚匀整，汤色杏绿明亮，香气毫香显、透熟，滋味清甜，叶底灰绿尚匀整”，总分介于87.5～88.9之间；寿眉样品的感官特征主要是“外形灰褐，汤色黄、尚亮，香气纯正，滋味尚醇，叶底粗老、尚匀”，总分介于82.3～84.2之间。由此可见，本研究所采用的福鼎白茶样品均具有较好的代表性，3 种不同花色的福鼎白茶在香气品质上具有较大的差异性（白毫银针＞白牡丹＞寿眉），适合进行下一步的挥发性萜类化合物对映异构体的检测分析实验。

2.2 福鼎白茶中挥发性萜类化合物对映异构体的定性及相对定量分析

采用前期实验中已筛选出的最优前处理及手性GC-MS分析方法[17]对不同花色福鼎白茶中的挥发性萜类化合物进行分析，经定性和相对定量分析后（表2），发现除α-蒎烯外，其余14 种萜类化合物的1～2 个对映异构体在所有样本中均可以被检测到，经数据处理后获得的不同花色福鼎白茶中挥发性萜类化合物的ER值及相对含量如表3所示。由于样本的厂家来源、生产日期及原料等级等均不同，部分萜类化合物的ER值及相对含量在不同样本间存在较大差异性，从而导致其ER值及相对含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）及标准差较高，但平行样本的重复性均较为理想，RSD普遍小于10%。

表2 挥发萜类化合物对映异构体的气味特征及特征离子Table 2 Odor characteristics and characteristic ions of volatile terpenoid enantiomers

图1 福鼎白茶中挥发性萜类化合物对映异构体的相对含量比较Fig. 1 Comparison of contents of volatile terpenoid enantiomers among different types of Fuding white teas

表3 福鼎白茶中挥发性萜类化合物的ER值及相对含量Table 3 ER values and relative contents of volatile terpenoids in different types of Fuding white teas

由于茶叶香气化合物众多复杂，为排除其他化合物的干扰且更直观对比不同花色福鼎白茶间各挥发性萜类化合物对映异构体的含量情况，本研究仅对各挥发性萜类化合物对映异构体在所有目标萜类化合物中所占的比例值进行分析，如图1所示，在3 种不同花色的白茶中，S-芳芳醇、S-Z-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B在所有可测得的挥发性萜类化物中的相对含量均在10%以上，其中白毫银针和寿眉中S-芳芳醇具有最高相对含量（25.25%，21.54%），而白牡丹中S-Z-橙花叔醇具有最高相对含量（29.73%）。除以上3 种化合物外，在白毫银针样品中，S-E-橙花叔醇、R-芳芳醇及S-α-紫罗兰酮的含量相对较高（5.15%～10.14%）；白牡丹样品中，(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、S-E-橙花叔醇及R-芳芳醇的含量相对较高（4.41%～4.79%）；寿眉样品中，S-E-橙花叔醇、R-α-紫罗兰酮、S-α-紫罗兰酮、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A及R-芳芳醇的含量相对较高（5.42%～9.00%）。反之，茶螺烷的4 种对映异构体在3 种花色的白茶样本中均仅具有极低的相对含量（＜1%）。

由茶样感官审评结果（表1）可知，白毫银针大多具有清甜的香气特征，而该茶类中含量较高的S-芳芳醇、S-E-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B均具有甜香特征，推测与白毫银针“清甜香”的品质形成具有较为直接的联系。据长期的茶叶加工及感官审评经验可知，白毫银针及白牡丹的“毫香”特征实为茶叶芽头上的绒毛冲泡后产生的植物草本香气，因此推测可能与茶叶中相对含量较高的清新木香型的S-Z-橙花叔醇、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、R-芳芳醇及S-α-紫罗兰酮等具有一定的联系。寿眉样品香气纯正，具有一定的草本清香特征，推测与具有类似香气特征的萜类化合物对映异构体相关，如S-Z-橙花叔醇、S-α-紫罗兰酮、R-芳芳醇、S-α-松油醇、(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2R,5S)-芳芳醇氧化物B等。值得注意的是，除以上挥发性萜类化合物外，在所测白茶香气成分中仍存在许多其他重要的非手性香气化合物，如苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇、香叶醇及水杨酸甲酯等，它们在色谱图上的峰响应度均高于本研究的目标挥发性萜类化合物，对白茶整体香气品质的形成起着重要的作用，但因不是研究重点，不再赘述。此外，由于各挥发性化合物的气味阈值差别迥异，以上化合物对白茶香气品质形成的具体贡献程度目前还无法确定，在今后的延续性工作中将采用香气活性值法或气相色谱-嗅闻-质谱联用技术继续深入研究。

2.3 福鼎白茶中挥发性萜类化合物的对映异构体分布比较

图2 福鼎白茶中挥发性萜类化合物对映异构体分布比较Fig. 2 Comparison of enantiomeric distribution of volatile terpenoids among different types of Fuding white teas

实验结果表明3 类白茶中各挥发性萜类化合物的主导立体构型（ER值＞50%）基本一致，S-柠檬烯、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、(2S,5R)-芳芳醇氧化物B、S-芳芳醇、(2R,5R)-茶螺烷A、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-α-松油醇、S-香香醇、S-α-紫罗兰酮、S-Z-橙花叔醇、S-E-橙花叔醇、(1R,2R)-茉莉酸甲酯及(1R,2S)-茉莉酸甲酯为相应萜类化合物中ER值较高的对映异构体。对不同花色福鼎白茶中挥发性萜类化合物的对映异构体组成分布进行进一步分析。如图2所示，虽然主导构型一致，但除芳芳醇氧化物B在3 种白茶中的ER值十分接近（3∶97～5∶95）外，大部分萜类化合物的ER值在不同花色的福鼎白茶间具有较明显的差异性。S-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-香香醇及S-α-紫罗兰酮在各化合物中的比例值与茶叶的采摘嫩度呈正比关系，在白毫银针中具有最高的比例值，而在寿眉样本中比例最低；其中R-4-萜品醇的差异性最为明显，在寿眉中从主导构型变成次要构型（43%）。橙花叔醇虽然是茶叶“花香”的关键嗅感化合物，然而其4 个不同对映异构体中仅R-Z-橙花叔醇及S-E-橙花叔醇呈现花香特性，S-Z-橙花叔醇及R-E-橙花叔醇均呈现青气及木香气息[26]；S-Z-橙花叔醇的比例与茶叶采摘嫩度呈反比，在白牡丹和寿眉中的比例值显著高于白毫银针中（高达96%），推测该化合物与寿眉呈现的草本清香具有一定的关联性。具有甜香、花香及奶油香的(2S,5S)-芳芳醇氧化物A在白毫银针（91%）中的比例值显著高于白牡丹及寿眉（74%、77%），推测与白毫银针的“毫香”具有一定的关联性。以上化合物的对映异构体分布规律为之后白茶的等级鉴别提供了新的技术思路。此外，其他萜类化合物ER值虽然在不同花色间的差异性较为明显，但未呈现出与嫩度相关的明显规律性，推测与茶叶本身的原料或品种具有一定的关联性。

2.4 福鼎白茶中挥发性萜类化合物对映异构体的多元统计分析

为探究3 个不同花色福鼎白茶中挥发性萜类化合物对映异构体含量分布的具体差异性，基于各对映异构体特征离子的峰面积数据进行多元统计分析，如图3所示。无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）[27]结果表明，白毫银针、白牡丹及寿眉样本的挥发性萜类化合物对映异构体轮廓具有较为显著的差异性，除个别样本（SM-4）外，各类别样本可以获得较好的聚类效果（R2X= 0.896，Q2=0.66；图3A）。采用进一步PLS-DA[28]对具有显著含量差异的关键萜类化合物对映异构体进行筛选，结果表明，3 种花色的福鼎白茶样本可被建立的PLS-DA模型较好地区分，且该模型的解释方差（R2Y=0.957）和交叉验证的预测能力（Q2=0.866）较为理想。进而对该模型进行200 次交叉验证，测试结果表明交叉验证模型的R2和Q2的截距分别为0.361和-0.851，Q2回归直线与Y轴的截距小于0，R2和Q2回归线的斜率接近于1，从而证明已建立的PLS-DA模型不存在过拟合现象，且模型具有较强的可靠性（图3C）。PLS-DA载荷图（图3D）表明了各变量与各组别样本间的关联性，是变量在PC1和PC2中2 个贡献率所占程度的可视化表示。其中，越远离X/Y轴的变量对该PLS-DA模型的贡献率越大，表示它们在3 个组别间的差异性越显著；越靠近各组别区域范围（图中方形散点附近）的变量与该组别的正关联性越大；如R-Z-橙花叔醇与白毫银针样本存在正相关性，而(1S,2S)-茉莉酸甲酯与白牡丹样本呈正相关。

图3 福鼎白茶中挥发性萜类化合物分析Fig. 3 Analysis of differences in volatile terpenoids among different types of white teas

综合以上分析结果，采用PLS-DA中的变量重要性因子（variable important for the projection，VIP）量化各萜类化合物对映异构体对已建立的PLS-DA模型的具体贡献率，VIP大于1的化合物被认为是区分不同花色白茶的关键性物质，包括S-柠檬烯、(2R,5R)-芳芳醇氧化物A、R-芳芳醇、(2S,5R)-茶螺烷B、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-α-紫罗兰酮、R-Z-橙花叔醇、S-Z-橙花叔醇、R-E-橙花叔醇、S-E-橙花叔醇及(1S,2S)-茉莉酸甲酯。为了验证以上分析结果的可靠性，采用非参数检验法（Kruskal-Wallis单因素方差分析）[29]对VIP大于1的12 种萜类化合物对映异构体进行进一步分析，分析结果表明以上化合物在3 个不同花色组别的样本间存在显著性差异（P＜0.01）。

最后，采用更直观的HCA法[30]对这12 种萜类化合物对映异构体的含量分布进行展示。图4中颜色从绿色方红色的过渡代表了含量的逐渐增加，越接近红色表明该化合物在相应茶叶样本中的峰面积越大。分析结果表明，这12 种化合物可聚类为4 类：1）R-α-紫罗兰酮在大部分寿眉样本中具有较高的含量分布；2）R-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-E-橙花叔醇、R-Z-橙花叔醇、S-柠檬烯及S-E-橙花叔醇在白毫银针样本中的含量显著高于其他2 种花色白茶；3）(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2S,5R)-茶螺烷B在白毫银针样本中的含量显著低于白牡丹及寿眉样本；4）S-Z-橙花叔醇及(1S, 2S)-茉莉酸甲酯在白牡丹样本中的含量显著高于其他2 种花色白茶。以上分布规律为白茶花色或等级判别模型的构建提供了新的技术支持，今后将在本研究的基础上扩大白茶的样本数量进行深入研究。

图4 福鼎白茶中关键挥发性萜类化合物对映异构体的含量分布热图Fig. 4 Heatmap of the quantitative distribution of the key volatile terpenoid enantiomers among different types of Fuding white teas

3 结 论

采用已建立的HS-SPME-手性GC-MS分析方法对11 个不同花色福鼎白茶样本中的香气成分进行分析，研究了14 种手性萜类化合物对映异构体在福鼎白茶中的相对含量及比例值。相对含量分析结果表明，S-芳芳醇、S-Z-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B在白毫银针、白牡丹及寿眉样本中普遍具有较高的相对含量，茶螺烷的4 种对映异构体在所有福鼎白茶样本中均具有极低的相对含量。ER值分析结果表明，3 种花色福鼎白茶中各挥发性萜类化合物的主导立体构型基本一致，其中S-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-香香醇、S-α-紫罗兰酮及(2S,5S)-芳芳醇氧化物A在各化合物中的比例值与茶叶的采摘嫩度呈正比关系，S-Z-橙花叔醇则呈现相反趋势。进一步对挥发性萜类化合物对映异构体的含量进行多元统计分析，结果表明，12 种萜类化合物对映异构体的含量分布在不同花色的福鼎白茶样本中具有显著性差异，其中R-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-E-橙花叔醇、R-Z-橙花叔醇、S-柠檬烯及S-E-橙花叔醇在白毫银针样本中含量最高，(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2S,5R)-茶螺烷B的含量与白毫银针样本呈负相关；S-Z-橙花叔醇及(1S, 2S)-茉莉酸甲酯在白牡丹样本中含量普遍较高；而R-α-紫罗兰酮的含量在寿眉样本中有较高的含量分布。以上研究结果填补了对映异构体分析在白茶香气化学领域的研究空白，为后续白茶香气品质形成机理研究提供一定的理论依据，也为白茶花色、等级判别及指纹图谱构建等实际应用提供了良好的技术思路。