苦橙花精油化学成分分析及其体外活性

董 雪,刘 霞,肖瑞欣,吕鹏飞,公衍玲*

(1.青岛科技大学 化工学院,山东 青岛 266042;2.潍坊护理职业学院,山东 潍坊 262500)

苦橙(Citrus AurantiumL.)是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citr us)常绿小乔木植物,也被称为酸橙,原产自阿尔及利亚、摩洛哥、突尼斯、西班牙等许多国家[1]。在我国,长江流域以南的湖南、浙江、江苏、贵州、江西等地均有种植苦橙[2]。苦橙的叶、花、果实等均有不同的用途,被加工后在各个领域得到广泛的应用[3]。苦橙花精油是通过蒸馏法从花瓣中提取的,主要成分为柠檬烯、芳樟醇等[4]。外观呈接近透明的浅黄色,香气浓郁、明快,带有自然甜鲜的花香、清新的柑橘果香和淡淡的苦味、药味的百合花香味,价格较高。柑橘属类植物被认为具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性及预防癌症的作用[5-8]。苦橙花精油可以缓解恶心、消化不良、便秘等症状,还具有镇静和抑制食欲等作用[8-9]。苦橙花精油在芳香行业应用较广泛,但关于其药理活性的基础研究较少。

因此,本研究拟分析苦橙花精油的化学成分并测定其体外活性,以期为苦橙花资源的开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

苦橙花精油,青岛青竺生物科技有限公司。产地摩洛哥,用无菌花生油溶解,分别制成0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－15个不同浓度的苦橙花精油溶液;透明质酸酶、酪氨酸酶,合肥博美生物公司;扑尔敏,湖北迈恩生物科技有限公司;熊果苷,成都曼思特生物科技有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、无乳链球菌和枯草芽胞杆菌,青岛市即墨区人民医院;ELISA试剂盒,南京建成生物工程研究所;RA W 264.7巨噬细胞,上海富衡生物科技有限公司;脂多糖(LPS),碧云天生物技术有限公司;其他试剂均为市售分析纯。

细胞培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司;酶标检测仪,TECANInfinite 200型,济南友泽仁信贸易有限公司;超净台,VS-1300L-U型,苏洁医疗器械(苏州)有限公司;紫外分光光度计,UV-1801型,北京北分瑞利分析仪器有限责任公司;立式压力蒸汽灭菌器,YXQ-LS-SII型,上海博讯实验有限公司医疗设备厂;全温振荡器,HZQ-Q型,金坛精达仪器制造厂;气质联用仪,7890B/7000C型,美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GC-MS分析苦橙花精油的化学成分

色谱条件:色谱柱是HP-5,载气为高纯氦气,进样口温度为280℃,色谱柱初始温度为50℃(程度升温)保持2 min,以每分钟10℃持续升至280℃,保持10 min,柱压为10 psi,分流进样,分流比为20∶1,进样量为1μL。

质谱条件:离子源为电子轰击离子源,电子能量为70 e V,接口温度为250℃,质量扫描范围为50～600,扫描间歇为1.0 s。所得图谱采用仪器自带的NIST14质谱数据系统自动检索,同时结合智能化工搜索引擎,进行精油组分定性,各组分含量由色谱峰面积用归一化法计算得到。

1.2.2 苦橙花精油的透明质酸酶抑制率测定

采用改良版的Morgan-Elson方法[10]检测苦橙花精油对透明质酸酶的抑制率。配制5 mg·mL－1的透明质酸原液,4℃保存。将50μL透明质酸原液和100μL缓冲液添加到250μL水中。将含有0.2 mol·L－1甲酸钠、0.1 mol·L－1NaCl和0.2 mg·mL－1牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液用甲酸调节至合适的p H(2.0～5.0)。将混合物在37℃下孵育10 min,然后加入50μL透明质酸酶和100μL不同浓度的苦橙花精油进行反应。加入110μL的碱性硼酸盐溶液,在沸水浴中加热4.5 min,终止酶促反应。将17.3 g H3BO3和7.8 g KOH溶解在100 mL水中制成硼酸盐溶液。向10 mL的碱性溶液中加入1 mL浓度为0.8 g·mL－1的K2CO3溶液。然后将试管置于冰水中20 min,之后加入1.5 mL的对二甲基氨基苯甲醛溶液(将20 g对二甲氨基苯甲醛溶于25 mL浓盐酸和75 mL冰醋酸的混合物中,制备该试剂,用前以400 mL冰醋酸稀释)。为了使反应混合物显色最大化,将试管在37℃下孵育20 min。用离心机在4℃、6 000 r·min－1下处理10 min后,取上清液测吸光度。扑尔敏为本次实验的阳性对照药物。实验重复进行3次,计算平均值。透明质酸酶抑制率y(%)计算见式(1)。

上式中:A是对照组溶液的吸光度(将苦橙花精油替换为醋酸缓冲液);B为对照组的空白溶液的吸光度(将透明质酸酶溶液/苦橙花精油替换为醋酸缓冲液);C为苦橙花精油组的吸光度;D为苦橙花精油空白溶液的吸光度(将透明质酸酶溶液替换为醋酸缓冲液)。

1.2.3 苦橙花精油的酪氨酸酶抑制率测定

根据文献中的方法测定酪氨酸酶活性[11-12]。将50μL的苦橙花精油在25℃下孵育10 min后,然后在96孔板中加入50μL浓度为135 U·mL－1的酪氨酸酶和50μL、0.03%的L-多巴溶液。在室温(25℃)下将上述混合物孵育5 min。在475 n m处,用酶标仪测定每个孔的吸光度。每次试验重复3次,取平均值。酪氨酸酶抑制率y(%)计算见式(2)。

其中,A是具有酶,但不具有苦橙花精油的吸光度;B是不具有苦橙花精油或酶的吸光度;C是具有酶和苦橙花精油的吸光度;D是具有苦橙花精油,但不具有酶的吸光度。

1.2.4 苦橙花精油的体外抑菌活性测定

苦橙花精油的体外抑菌活性是采用抑菌圈方法测定的。将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞杆菌菌悬液倒入盛有固体培养基的锥形瓶中,充分震荡混匀,迅速倒入无菌培养皿中,放冷,待培养基凝固后打孔,分别加入不同浓度的苦橙花精油和溶剂各20μL,然后放置在37℃的培养箱中,培养24 h后观察并记录所有抑菌圈的大小。每组实验平行3次,计算平均值。

1.2.5 苦橙花精油的体外抗炎活性测定

1.2.5.1 细胞培养

RA W264.7细胞采用含有10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基,同时添加1%的青链霉素,培养于37℃、5%CO2,饱和湿度的培养箱中。

1.2.5.2 MTT法检测苦橙花精油的细胞毒性

细胞分为6组,分别为空白组、苦橙花精油(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1)组,每组设置3个复孔。取96孔板,向每个孔中加入100μL细胞悬液(1×105个·mL－1),然后分别吸取100 μL的DMEM完全培养基加到每个孔中,将孔板平放于于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。每孔加入0.5 mg·mL－1的MTT溶液100μL,继续培养4 h。分别在每孔中加入150μL DMSO,使结晶物充分溶解,在490 n m处,用酶标仪检测并记录吸光度A,根据吸光度A来判断不同浓度的苦橙花精油对细胞活性的影响。细胞存活率x(%)计算公式见式(3)。

式中:A0为空白组的吸光度;A1为实验组的吸光度;A2为对照组的吸光度。

1.2.5.3 ELISA试剂盒检测炎症因子IL-β、IL-6、TNF-α的表达

将RA W264.7细胞(1×105个·mL－1)接种于96孔培养板中培养24 h。分为7个组,即空白组(加DMEM培养基)、炎症模型组和5个给药组。模型组和给药组均用LPS(1μg·mL－1)诱导细胞炎症。给药组分别加浓度为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油,空白组和模型组分别给与等体积的DMEM培养基,继续培养24 h。经消化、离心后,取细胞上清液,严格按照ELISA试剂盒的说明操作,测定细胞上清液中促炎细胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的浓度。

2 结果与讨论

2.1 苦橙花精油的GC-MS分析结果

苦橙花精油的GC-MS总离子图见图1。苦橙花精油检测的主要成分分析见表1。苦橙花精油中共检测出36种化合物,其主要的化合物类别为醇类、萜烯类和酯类化合物,含量分别为49.77%、22.93%和24.22%。其中芳樟醇的含量占比最高,为24.72%,因此,芳樟醇是苦橙花精油的主要成分。其次,苦橙花精油中的相对含量较高的酯类化合物(乙酸芳樟酯),为11.56%,萜烯类化合物中桧烯含量最高,为7.01%。酚类、醛类和酮类化合物相对较少,分别为1种、2种和1种。苦橙花精油成分复杂,推测其药理活性较广泛,同时也在一定程度上限制了对其的进一步开发利用。

图1 苦橙花精油的GC-MS总离子图Fig.1 Total ion diagram of GC-MS of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers

表1 苦橙花精油检测的主要成分分析Table 1 Analysis of main co mponents of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flowers

2.2 苦橙花精油对透明质酸酶的抑制作用

苦橙花精油与扑尔敏浓度对透明质酸酶抑制率的影响见图2。由图2可见,随着浓度的变化,苦橙花精油可以不同程度地抑制透明质酸酶的活性。在0.5 mg·mL－1到2.0 mg·mL－1浓度范围内,苦橙花精油对透明质酸酶的抑制作用呈剂量依赖性。在2.0 mg·mL－1时,苦橙花精油对透明质酸酶的抑制率达到最大值,在2.5 mg·mL－1时抑制率不再升高,趋于平缓,机理有待进一步研究。在本研究中,苦橙花精油显示出一定的抑制透明质酸酶活性,虽然活性低于同剂量的扑尔敏,但其来源于天然植物,安全范围大,可能是一种潜在的抗过敏药物。

图2 苦橙花精油与扑尔敏浓度对透明质酸酶抑制率的影响Fig.2 Hyaluronidase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and clor phena mine maleate

2.3 苦橙花精油对酪氨酸酶的抑制作用

苦橙花精油对酪氨酸酶的抑制作用见图3。在各种美白靶标中,酪氨酸酶是黑色素生物合成中的主要酶,它催化从L-酪氨酸到3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸(L-DOPA)和从L-DOPA到多巴醌的氧化反应。多巴醌通过氧化聚合产生黑色素。因此,具有酪氨酸酶并显示出氧化抑制作用的试剂将是皮肤美白治疗的合适靶标[13]。本研究发现,苦橙花精油可不同程度地抑制酪氨酸酶活性,从而抑制黑色素的形成,且呈现出剂量依赖关系。同时还发现,苦橙花精油对酪氨酸酶的抑制活性略优于同等剂量的熊果苷,而熊果苷作为美白剂在化妆品中广泛应用。因此,苦橙花精油作为新型美白成分值得进一步开发研究。

图3 苦橙花精油和熊果苷浓度对酪氨酸酶抑制率的影响Fig.3 Tyr osinase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and ar butin

2.4 苦橙花精油的抑菌实验结果

苦橙花精油具有清新、独特的香味,同时也具有多种活性,如抑菌和消炎等。本研究检测了苦橙花精油的体外抑菌活性,结果见图4。

图4 不同浓度的苦橙花精油对5种细菌的抑制效果图Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flo wers on five kinds of bacteria

由图4可以看出,苦橙花精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞杆菌均表现出不同程度的抑制作用。在革兰氏阳性菌中,苦橙花精油对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强,对大肠杆菌的抑制作用较弱。HSOUNA等[14]也报道了类似的结果,他们报道苦橙花精油对所有检测到的革兰氏阳性和阴性细菌均有抗菌活性。结果表明,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌相比,前者对苦橙花精油更为敏感。这些差异可以部分归因于革兰氏阴性菌的双膜细胞膜结构比革兰氏阳性菌的单膜结构更加复杂。革兰氏阴性细菌外膜中亲水性多糖链的存在已被证明有助于抵抗疏水性植物油。

2.5 苦橙花精油对细胞活性的影响

图5实验结果显示,经浓度为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油处理的RA W264.7细胞与空白对照组的RA W264.7细胞相比,细胞活性没有显著差异,说明苦橙花精油对RA W264.7细胞不具有细胞毒性。

图5 苦橙花精油浓度对RA W264.7细胞活性的影响Fig.5 Effect of essential oil from Citr us aurantium L.flowers on the activity of RAW264.7 cells

2.6 苦橙花精油对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎性因子的影响

RA W264.7是小鼠腹腔巨噬细胞细胞系,常用于建立炎症细胞模型。在本实验中,使用LPS诱导RA W264.7巨噬细胞炎症模型,通过ELISA试剂盒测定IL-β、IL-6、TNF-α等炎症因子的含量,从细胞、分子水平探讨苦橙花精油的抗炎作用,旨在为苦橙花的进一步开发和利用提供依据。

苦橙花精油对LPS诱导的RA W264.7细胞分泌IL-β、IL-6、TNF-α的影响见图6。结果显示,与空白组相比,LPS组中IL-β、IL-6、TNF-α水平显著升高,其差异具有统计学意义(P＜0.01),提示LPS可诱导细胞发生炎症。与LPS组比较,5个不同浓度的苦橙花精油均能明显地抑制由LPS诱导的RA W264.7炎症细胞中IL-β、IL-6、TNF-α的升高,且差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),且随着浓度的增加,其抑制作用加强,表现出剂量依赖关系。

图6 苦橙花精油浓度对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响Fig.6 Effect of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers on expression of infla mmator y cytokines in LPS-induced RA W264.7 cells

3 结 论

通过GC-MS分析,从苦橙花精油中共检识出36种化合物,其主要的化合物类别为醇类、萜烯类和酯类化合物,含量分别为49.77%、22.93%和24.22%。苦橙花精油能显著抑制透明质酸酶和酪氨酸酶的活性,具有一定的抗过敏活性和较好的美白效果。同时,本研究结果显示苦橙花精油具有广谱抗菌活性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞杆菌这5个菌株均具有一定的抑制作用,同时还能抑制LPS引起的炎症因子的分子,具有抗炎活性。苦橙花精油的体外活性可能与其含有的萜类、醇类等物质有关。实验结果为苦橙花精油在天然美白剂、抗过敏以及抑菌抗炎剂的应用领域提供了一定了理论依据,考虑可以将其用于日化产品、功能性食品和医药领域。然而,为阐明苦橙花精油潜在的有效性,还需要对其体内效价和作用机制进行进一步的研究。