紫苏籽油双层乳状液的制备及其物理化学稳定性评价

于有强，高雅馨，朱巧莎，牟德华,*，段盛林，侯占群,*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050000；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

紫苏作为药食两用的植物，具有很好的功能和应用价值[1-2]。紫苏籽油中含有α-亚麻酸66.45%、棕榈酸17.30%、亚油酸2.62%、油酸2.25%，用高效液相色谱法对主成分α-亚麻酸进行定量分析，紫苏籽样品中含量为275 mg/g[3]。紫苏籽油具有着抗衰老、降血脂、防癌等诸多功效，是一种极具开发潜力的功能性油脂[4-7]。但是由于紫苏籽油的较差的氧化稳定性、水溶性及分散性，严重限制了其应用范围。因此，如何扩大应用范围、保护其生物活性及提高其氧化稳定性已成为亟待解决的难题。

近年来，水包油（O/W）型乳状液得到了广泛的应用，通过乳状液的制备，油脂的物化特性得到改善，并能促进人体对必需脂肪酸的吸回[8]。如研究较多的单层或者多层乳状液对β-胡萝卜素理化性质的影响[9-15]。此外还有如单层或者多层乳状液对亚麻籽油、大豆油及橄榄油等功能脂质物理化学稳定性的研究[16-18]。乳化剂的特性以及如何选用更好的乳化剂成为乳状液研究重点。Lee等[19]研究了亚麻籽油乳状液中表面活性剂（吐温20、吐温80和大豆卵磷脂）和蛋白质类乳化剂（大豆蛋白质分离物和乳清蛋白分离物）的乳化能力，结果显示表面活性剂表现出更高的乳化能力。Zhao Jingjing等[20]研究了可溶性大豆多糖和甜菜果胶对乳铁蛋白包覆橙油乳状液理化性质的影响，结果表明，通过吸附阴离子多糖，改善了乳铁蛋白包覆橙油乳液的物理化学稳定性。Jin Qiangwei等[21]研究了玉米纤维胶、疏水改性淀粉、阿拉伯胶与可溶性大豆多糖的界面动力学、油水界面黏弹性响应及乳状液稳定机理的比较，结果显示，玉米纤维胶的吸附膜是独特的，因为它表现出主要黏性，在整个实验中显示出明显增加的储能模量而没有饱和值，而疏水改性淀粉在界面处产生纯黏性层，具有非常低的黏度和快速的成形动力学，相比之下，阿拉伯胶与可溶性大豆多糖都形成更坚硬，类似固体的层。Hou Zhanqun等[22]研究了大豆可溶性多糖和壳聚糖对稳定β-胡萝卜素乳状液的理化稳定性和流变性影响，结果表明，乳状液的Zeta电位、粒径和流变性质在很大程度上取决于壳聚糖使用量，壳聚糖的吸附改善了β-胡萝卜素乳状液的物理化学稳定性。综上所述，对紫苏籽油乳状液研究报道较少，仅有如吴旭锦[23]紫苏籽油纳米乳的研究，纳米乳处方筛选结果显示：可形成纳米乳的表面活性剂为吐温类（80和60）、司盘类（80和60）、蓖麻油聚氧乙烯醚-40和氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-40，助表面活性剂为无水乙醇、甘油、1,2-丙二醇和正丁醇，油相为肉豆蔻酸异丙酯、液体石蜡、橄榄油和小麦胚芽油，形成的为水包油型乳状液。Chivero等[24]研究了黄原胶和瓜尔豆胶对大豆多糖紫苏籽油乳状液稳定性的影响，结果显示，乳状液中加入少量的黄原胶和瓜尔豆胶可以显著降低液滴尺寸，并且乳状液特性与连续相的流变学特性密切相关。

由于大豆多糖的良好的乳化性能，能够形成比较稳定的紫苏籽油乳状液，而壳聚糖是带有正电荷的物质，能够吸附在大豆多糖表面，形成双层乳状液。本实验应用两种乳化剂，研究两种乳化剂对紫苏籽油乳状液物理化学稳定性的影响，为拓宽紫苏籽油在食品领域应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏籽油 河北欣奇典生物科技有限公司；可溶性大豆多糖-S-CA200 不二富吉（北京）科技有限公司；壳聚糖 美国Sigma公司；氨水 福晨（天津）化学试剂有限公司；无水乙醇、石油醚、乙酸 北京化工厂；无水乙醚 北京市通广精细化工公司；异辛烷 天津市博迪化工有限公司。试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PB602-N型电子精密天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T25基本型ULTRA-TURRAX分散机 德国IKA公司；Homelab型高压均质机 意大利FBF公司；S3500激光粒度分析仪 美国麦奇克有限公司；LUMiSizer 611型稳定性分析 德国LUM仪器公司；Nano-ZS90激光粒度电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；907自动电位滴定仪 瑞士万通公司；SD-I标准型恒温恒湿箱 上海邑优机械设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫苏籽油单层乳状液分析（芯材紫苏籽油、壁材大豆多糖）

1.3.1.1 紫苏籽油单层乳状液的制备

准确称取一定质量的大豆多糖溶于50～60 ℃的蒸馏水中，高速搅拌使其充分溶解，高速剪切过程中缓慢加入紫苏籽油形成粗乳状液，再经高压均质机（一级均质压力50 MPa，二级均质压力5 MPa）均质2 次，制得总固形物质量分数为20%乳状液备用。

1.3.1.2 紫苏籽油单层乳状液粒径分析

采用S3500型激光粒度分析仪进行粒径以及粒径分布的分析，应用湿法分析。用滴管取乳状液逐滴滴入进样槽中，观察达到仪器测样所需浓度并进行粒度检测，有效确定粒子的粒径大小及粒度分布，粒径大小以体积平均粒径表示。

1.3.1.3 紫苏籽油单层乳状液Zeta电位分析

采用Nano-ZS90激光粒度电位分析仪进行电位测量。该仪器用激光多普勒微量电泳法测量Zeta电位，分子和颗粒在施加的电场作用下做电泳运动，其运动速率和Zeta电位直接相关，使用专利型激光相干技术M3-PALS（相位分析光散射法）检测其速率。计算电泳迁移率，并计算Zeta电位。本实验将样品稀释500 倍注入到测量皿中，放入测量室中进行Zeta电位测量。

1.3.1.4 紫苏籽油单层乳状液物理稳定性分析

采用稳定性分析仪进行乳状液物理稳定性分析。参考韩丽丽等[25]方法，用注射器取样品均匀注射于2 mm离心管中，并且设置转速4 000 r/min、温度25 ℃、每10 s一条谱线和共500 条谱线的条件下离心分析。最终以澄清指数为指标进行稳定性分析。

1.3.2 紫苏籽油双层乳状液制备及分析

1.3.2.1 紫苏籽油双层乳状液的制备

参考Hou Zhanqun等[22]方法并做修改。制备100 mmol/L醋酸缓冲溶液，用1 mol/L HCl溶液调pH 3.0。准确称取一定质量的壳聚糖溶解在缓冲溶液中，将溶液以200 r/min的速率搅拌过夜以确保完全分散和溶解。将1.3.1.1节方法制备的紫苏籽油粗乳状液与溶解过夜的壳聚糖溶液高速剪切下进行混合，再经高压均质机（一级均质压力50 MPa、二级均质压力5 MPa）均质2 次，制得双层乳状液备用。

1.3.2.2 紫苏籽油双层乳状液Zeta电位分析

方法同1.3.1.3节。

1.3.2.3 紫苏籽油双层乳状液粒径分析

方法同1.3.1.2节。

1.3.2.4 紫苏籽油双层乳状液物理稳定性分析

方法同1.3.1.4节。

1.3.3 紫苏籽油双层乳状液化学稳定性分析

选择壳聚糖质量分数分别为0%、0.2%、0.4%、0.6%的紫苏籽油双层乳状液进行（63±1）℃加速保藏实验，采用150 mL玻璃瓶密封包装，放于恒温培养箱中恒温静置，分别在第1、3、5、7、14、21、28、35天取出3 瓶，进行过氧化值检测。紫苏籽油提取：参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》对样品进行碱法处理[26]。过氧化值检测：参考GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》中电位滴定法[27]。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行分析，并采用Origin 8.1软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 芯壁比对紫苏籽油乳状液粒径及稳定影响

2.1.1 芯壁比对紫苏籽油乳状液平均粒径及Zeta电位影响优化合适的芯壁比（芯材紫苏籽油、壁材大豆多糖，质量比），即能够形成稳定乳状液的最小的乳化剂用量。在双层乳状液制备过程中若第1层乳化剂浓度过低，分散相液滴界面不能达到饱和吸附，会使第2层乳化剂在加入的过程中一部分与第1层乳化剂相互作用，一部分则吸附至乳液界面，从而会引起液滴的聚合，不利于使乳液保持稳定性；但若乳化剂浓度过高，会有过多的乳化剂溶解在水相中，这些在水相的乳化剂会与新加入的乳化剂发生静电相互作用，从而促进乳状液的失稳。由图1A可以看出，随着芯壁比的增加，乳状液Zeta电位的绝对值增加，但是都保持在-44～-54 mV之间，都是在保证液滴之间有较大的静电力，阻止液滴凝聚。由图1B可以看出，在芯壁比小于2∶1时，随着芯壁比的增加，乳状液粒径逐渐增加但没有显著变化，然而从4∶1开始乳状液粒径显著增加。在乳状液形成过程中，在乳化剂浓度很低的情况下，分散相液滴界面不能形成足够紧密的界面膜，可能造成较小乳滴的聚合，不利于乳状液获得较小粒径，随着乳化剂用量增加，界面上吸附的分子也增加，膜的强度相应增大，液滴难以聚结，乳状液的稳定性较好。另外，随着大豆多糖浓度的增大，乳状液的黏度明显增大。根据斯托克斯定理，高黏度体系中，液滴具有较低的沉降速度，从而有利于得到更稳定的乳状液体系。

图1 芯壁比对紫苏籽油乳状液Zeta电位（A）和平均粒径（B）的影响Fig. 1 Effect of core-to-wall ratio on zeta potential (A) and average particle size (B) of perilla seed oil emulsion

2.1.2 紫苏籽油乳状液物理稳定性分析

通过4 000 r/min离心5 000 s测定不同芯壁比乳状液澄清指数（不稳定性指数），澄清指数越高代表乳状液越不稳定，反之乳状液稳定。由图2可看出，在芯壁比0.25∶1～2∶1乳状液很稳定，澄清指数没有显著变化；当芯壁比大于2∶1时澄清指数显著的增加，尤其高于6∶1时乳状液非常不稳定。根据斯托克斯定理，乳状液粒径越小，液滴具有较低的沉降速度，从而有利于得到更稳定的乳状液体系。对应粒径的变化（图1B）可知，在芯壁比0.25∶1～2∶1范围内乳状液粒径较小，乳状液稳定性好；当芯壁比大于2∶1乳状液粒径显著增大，乳状液稳定性也显著降低。通过乳状液粒径与物理稳定性分析可知，可能2∶1是最适的芯壁比，此比例下乳化剂（大豆多糖）的浓度是形成稳定乳状液所需的最低水平。但是后续壳聚糖具有很高的黏度，考虑到实验的方便选择制备芯壁比4∶1、固形物5%的乳状液进行后续双层乳状液实验。

图2 不同芯壁比紫苏籽油乳状液的澄清指数Fig. 2 Clarification index of perilla seed oil emulsions with different core-to-wall ratios

2.2 壳聚糖对紫苏籽油乳状液的影响

2.2.1 紫苏籽油双层乳状液Zeta电位分析

图3 紫苏籽油双层乳状液Zeta电位Fig. 3 Zeta potential of perilla seed oil double-layer emulsions

由于壳聚糖的静电稳定性和黏度对乳状液体系的巨大贡献，其显示出足够的物理稳定性[28]。随着层层沉积技术的发展，双层、三层等多层乳状液备受关注，壳聚糖起到重要的作用。Julio等[29]用壳聚糖与卵磷脂制备了双层O/W乳状液，带正电荷的壳聚糖吸附在带负电荷液滴上，使其具有良好的物理稳定性，并形成了抗脂质氧化的保护体系，加强化学稳定性。Chang等[30]研究β-乳球蛋白纤维-壳聚糖复合物对鱼油乳状液物化稳定性的影响，结果表明，由于壳聚糖阳离子的增强分子间静电斥力增强，不易于液滴聚集，有很好的物理稳定性。并且β-乳球蛋白纤维-壳聚糖复合物乳状液较β-乳球蛋白纤维乳状液有更好的抗氧化、热稳定等优点。Sivapratha等[31]研究了酪蛋白酸钠-海藻酸钠-壳聚糖对亚麻籽油乳状液的氧化稳定性及应激因素的影响，结果表明添加壳聚糖的三层结构较其他方式都能更好地抑制油脂氧化降解，具有更好的耐盐、耐热等性质。

图3显示，未添加壳聚糖的情况下紫苏籽油乳状液电位为-44 mV，随着壳聚糖质量分数的增加乳状液的Zeta电位逐渐增大，并且由负值变为正值，当壳聚糖质量分数达到1%时紫苏籽油乳状液Zeta电位为60 mV。这种Zeta电位的变化表明，带正电荷的壳聚糖分子能够吸附到带负电荷的乳状液液滴表面。在β-乳球蛋白原纤维-壳聚糖复合物稳定的乳状液研究中也有类似Zeta电位移动现象，Zeta电位从负值方正值的转移表明带正电荷的壳聚糖通过与带负电荷大豆多糖共同吸附在油/水界面上，并且随着壳聚糖质量分数的增加Zeta电位值逐渐增大，最后稳定在一个较高的Zeta电位值[30]。

2.2.2 紫苏籽油双层乳状液粒径分析

图4 紫苏籽油双层乳状液粒径大小（A）和粒径分布（B）Fig. 4 Particle size (A) and distribution profile (B) of perilla seed oil double-layer emulsions

从图4A可以看出，壳聚糖质量分数在0%～0.2%范围内乳状液粒径先变小然后变大，尤其壳聚糖质量分数在0.1%～0.2%过程中乳状液粒径急剧增大，这是由于大量的液滴聚集，粒径增大。壳聚糖质量分数高于0.2%时乳状液粒径急剧变小，较高质量分数壳聚糖的乳状液之间粒径大小没有显著变化，并且较高质量分数时乳状液粒径低于低质量分数范围乳状液粒径。Zeta电位是影响乳状液粒径的重要因素，结合图3进行分析。当少量添加壳聚糖时粒径减小是因为壳聚糖的添加使体系黏度增大，液滴碰撞几率减小，并且乳状液Zeta电位的绝对值保持在乳状液较稳定的范围内，阻碍了液滴的絮凝，所以粒径有减小的趋势[18]。但是随着壳聚糖质量分数的增加，乳液粒径增大，并且在壳聚糖质量分数为0.2%时达到最大5.21 μm。因为随着壳聚糖质量分数的增加，溶液Zeta电位被中和，体系Zeta电位的绝对值减小，液滴絮凝，粒径变大，最大粒径时乳液Zeta电位仅为3.6 mV。当壳聚糖质量分数高于0.2%时粒径急剧变小，在壳聚糖质量分数在0.4%时粒径变为1.185 μm，质量分数继续增加，乳状液粒径没有显著变化。说明可能0.4%的壳聚糖质量分数完全覆盖在液滴表面，形成了稳定的双层乳状液，此时的Zeta电位为43 mV。Hou Zhanqun等[22]在研究壳聚糖对大豆多糖β-胡萝卜素乳状液物理化学稳定性中有类似的现象。由图4B可以看出，壳聚糖质量分数0.2%的乳状液粒径最大，而且有3 种主要粒径大小分布，分布不均；其他壳聚糖质量分数的乳状液粒径分布集中，尤其壳聚糖质量分数在0.4%及更高时，分布集中并且较小的粒径。

2.2.3 紫苏籽油双层乳状液物理稳定性分析

图5 紫苏籽油双层乳状液的澄清指数Fig. 5 Clarification index of perilla seed oil double-layer emulsions

通常乳状液界面聚电解质之间静电相互作用强度以及在界面形成的复合物的性质取决于其浓度、本身表面带电基团的分布、分子结构的稳定以及所带电荷的分布及密度等。此外，从热力学方面考虑，进一步开拓这个新方法面临的主要问题是乳状液在制备过程中的絮凝问题，即在多糖的加入过程中，多糖浓度过低或过高引起的乳状液不稳定现象。因此，并不是所有应用聚电解质间的相互作用都能促进乳状液的稳定性，乳状液体系及乳化剂浓度的选择不当，可能会导致絮凝的发生，从而最终导致乳状液的不稳定。为更进一步研究壳聚糖对大豆多糖稳定的紫苏籽油双层乳状液物理稳定性的影响，本实验以物理稳定性为指标，研究壳聚糖质量分数对乳状液稳定性影响。测定样品4 000 r/min离心5 000 s内不同壳聚糖质量分数乳状液澄清指数（不稳定性指数），澄清指数越高代表乳状液越不稳定，反之乳状液稳定。由图5可以看出，乳状液在壳聚糖质量分数0%～0.1%范围内随着壳聚糖质量分数增加乳状液稳定性增加；在壳聚糖质量分数增加到0.2%时乳状液稳定性变差；当壳聚糖质量分数增加到0.4%时，乳状液变得非常稳定，并且随着壳聚糖质量分数增加，乳状液一直保持稳定状态。乳状液的稳定性与乳状液的Zeta电位、粒径和黏度等息息相关。在壳聚糖质量分数0%～0.1%范围内随着壳聚糖质量分数的增加乳状液的黏度增强，虽然Zeta电位的绝对值减小，但是其数值也在较稳定范围内，能阻碍液滴的凝聚，总体来说，乳状液稳定性增强；当壳聚糖质量分数0.1%～0.2%变化过程中，正负电荷中和，乳液Zeta电位急剧变化，由-27.4 mV变为3.6 mV，此电位下乳状液容易絮凝聚集。即使乳状液黏度仍在增加，但是乳状液稳定性依然下降；当壳聚糖质量分数增加到0.4%时，乳状液变得很稳定，壳聚糖吸附液滴表面，乳状液Zeta电位达到43 mV，是一个很稳定的Zeta电位范围。并且实验中观察到壳聚糖质量分数从0.4%开始乳状液黏度有显著增强，阻碍了液滴的凝聚与上浮，这也促进乳状液的稳定。

2.3 紫苏籽油乳状液化学稳定性分析

图6 紫苏籽油双层乳状液化学稳定性Fig. 6 Chemical stability of perilla seed oil double-layer emulsions

采用壳聚糖质量分数分别为0%、0.2%、0.4%、0.6%紫苏籽油双层乳状液进行（63±1）℃加速保藏实验，测其过氧化值，进行化学稳定性分析，结果如图6所示。4 种乳状液随着贮藏时间的延长其过氧化值均上升，其增长速率在前1 周内增长缓慢，1 周后增长速率增大，即油脂氧化速率加快。整体来看，不含壳聚糖的单层乳状液过氧化值最高，壳聚糖的添加对乳状液氧化起到不同程度的抑制作用。是由于壳聚糖吸附在液滴表面，形成了壳聚糖保护层，阻碍了促进油脂氧化的氧气、金属离子等与油脂的接触，从而起到保护的作用[32]。但是不同添加量所形成的双层乳状液对油脂的保护效果有明显差异。由图6可以看出，在1 周内3 种不同壳聚糖质量分数乳状液过氧化值变化基本一致，但是随着时间的延长，壳聚糖质量分数0.2%和0.6%两种乳状液过氧化值开始高于0.4%的乳状液，并且差距逐渐增大。壳聚糖质量分数0.2%的乳状液电位小，液滴易凝结，粒径较大，尤其随着贮藏时间的延长出现了明显的分层的现象，乳状液变得很不稳定，失去了稳定的保护层，较易与促进油脂氧化的物质接触。壳聚糖质量分数过高抑制油脂氧化效果减弱，如0.6%壳聚糖质量分数乳状液过氧化值与0.2%壳聚糖质量分数乳状液相接近，在贮藏过程中有液滴聚集的现象，乳状液的稳定性减弱，从而降低抑制氧化的效果。壳聚糖质量分数0.4%的乳状液效果最好，过氧化值最低，氧化速率最慢。

3 结 论

采用紫苏籽油为芯材，大豆多糖和壳聚糖为壁材，分别制备了紫苏籽油单层与双层乳状液，并且对乳状液的粒径、Zeta电位、物理稳定性以及化学稳定性进行研究。结果表明，芯壁比对单层乳状液粒径影响显著，最佳芯壁比为2∶1。双层乳状液制备过程中，随着壳聚糖质量分数的增加双层乳状液的Zeta电位逐渐增大，并且由负值变为正值，说明壳聚糖成功吸附在大豆多糖稳定的单层乳状液表面，当壳聚糖质量分数大于0.4%时Zeta电位为43 mV且增加速率变小。双层乳状液的粒径随着壳聚糖质量分数的增加，呈现先增大再减小的趋势，壳聚糖含量0.2%时达到最大粒径为5.21 μm，0.4%时达到最小粒径为1.185 μm，说明在壳聚糖吸附到大豆多糖稳定的单层乳状液界面，并与大豆多糖发生静电吸附作用从而在液滴表明形成稳定的膜层。结合物理稳定性以及氧化稳定性结果表明，适度控制壳聚糖质量分数可显著改善乳状液的物理稳定性和化学稳定性，具有在食品体系中应用的巨大潜力。尽管如此，后续研究中还需要进一步明晰壳聚糖与大豆多糖分子间在乳状液界面的相互作用，从热力学及动力学角度对两种多糖分子间的相互作用机制进行更深层次的探索，应用现代仪器分析手段对多糖分子间形成的复合物进行表征，从而更加清晰地了解其微观结构和性能。