铜绿假单胞菌及其耐药基因PCR检测与耐药机制

冯礼尚

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称绿脓杆菌，专性需氧，是一种常见的条件致病菌，易引起免疫力低下的人群以及烧伤、外伤、眼角膜和外耳道等部位的感染，甚至引起败血症，是医院感染常见的病原菌，也是各种动物的致病菌。该菌分布广泛、抗性强、耐营养贫乏，能在纯净水中长期存活，易形成生物膜（Biofilms，BF），产生多药耐药性，是医学难治性病原菌之一。因此，就铜绿假单胞菌的耐药机制与耐药基因转移传播的途径以及扩增DNA的多聚酶链反应（PCR）技术在PA菌株及其耐药基因检测研究中的应用进行综述。

1 菌种检测与菌株鉴定

1.1 菌种检测

利用常规细菌培养法检测环境中PA菌，较为耗时费力，而用PCR方法可以在较短时间内得出检测结果。在病原菌感染性疾病的诊断中需要及时精准地确定致病菌的种类和株型以便有针对性地用药。PCR检测方法具有特异、敏感、快速的优点，用于菌种检测和临床诊断更具有实用价值。张伟等[1]采用直接PCR方法扩增检测PA菌的外毒素A（ETA）基因，在4 h内得出结果。张淑红等[2]应用常规PCR法检测PA外膜蛋白基因oprL用时少于24 h，优于菌株的平板培养法。杨滴等[3]用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测PA的ETA基因，其特异性和灵敏性都很高，其方法可用于食品中PA的快速检测和鉴定。吴炳坤等[4]应用逆转录荧光PCR（RT-PCR）法检测PA活菌，利用的是PA的DNA旋转酶gyrB基因序列。这4种PCR方法检测的DNA序列都是PA特异的，其核心是设计合成特异性引物用于PA菌独特DNA序列的扩增，然后用凝胶电泳检测扩增的DNA。环介导的等温扩增技术（LAMP）是常规PCR的改进，用于DNA检测具有很大的优势。刘伟等[5]采用LAMP法检测PA菌ETA基因获得了很好的检测效果。李羽翡[6]等用LAMP法检测PA，从基因组提取到检测报告只用了100 min，达到快速检测目的。由常规PCR技术衍生的常用于菌种分类、菌株检测和鉴定的PCR方法有巢式PCR、菌落PCR、随机引物PCR、通用PCR和多重PCR等，这些方法都需要根据菌种或菌株特有的已知基因DNA序列设计适宜的引物并对PCR反应条件进行优化才能有效扩增目的基因，达到检测目的。

1.2 基因分型与菌株鉴定

按照生化和遗传性质的不同标准，PA可分成许多不同的株型，每一种株型具有其特定的基因型。不同的耐药菌株所含的耐药基因及其耐药机制不同，临床需要根据耐药分型选择有效的抗菌药，菌株耐药基因型与耐药机制的检测分析是其用药的前提。PCR技术是当前检测PA耐药基因并分析基因表达活性与耐药机制的有效方法[7-8]。不同菌株的传染性、致病性与流行特点不同，需要区别对待。PCR技术适用于PA菌株分子流行病学特点的调查研究，评价感染的治疗效果[9]。检测耐药基因表达的PCR方法有反转录PCR（RT-PCR）、qPCR、原位PCR等；检测基因变异的PCR方法有单链构象多态PCR（SSCP-PCR）、限制性片段长度多态性PCR（RFLP-PCR）、随机引物多态PCR（也称任意引物PCR，AP-PCR）[10-11]、mRNA差异显示PCR（DD-PCR）等。

2 耐药基因检测与耐药机制分析

铜绿假单胞菌（PA）包含细菌所有的6种类型的耐药机制，包括抗菌药灭活酶的产生、药物作用靶点结构变异、细胞壁外膜通透性降低、细胞膜表面形成主动外排泵系统、形成生物膜屏障、不良环境导致的适应性耐药等。

2.1 PA产生抗菌药灭活酶

抗菌药灭活酶有两种：（1）水解酶，如β-内酰胺酶（β-lactamase，BLA），水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，导致青霉素类、头霉素类、碳青霉烯类失活；（2）钝化酶，即修饰酶，通过化学修饰使抗菌药失活。氨基糖苷类抗生素的修饰酶包括乙酰转移酶（acetylase，AAC）、核苷化酶（nucleotidylase，ANT）、腺苷化酶（adenylase，AAD）和磷酸化酶（phosphorylase，APH）。PA菌的修饰酶基因、头孢菌素酶基因在染色体上，而广谱和超广谱β-内酰胺酶基因由质粒携带。β-内酰胺酶类有多种。（1）AmpC类：由染色体基因编码，属于诱导酶，在菌体不接触β-内酰胺类抗生素时只产生少量的酶，反之酶产量会增加[12]。（2）超广谱类：根据分子结构及来源，超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs） 分 为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他类型5类，PA菌主要携带SHV型、OXA型及其他类型中的PER型和VEB1型酶[13-15]。（3）金属β-内酰胺酶：简称金属酶，广泛水解各类β-内酰胺类抗生素，结构和作用机制多样化，其介导的耐药性难以对付。PA的主要金属酶种类有IMP型、VIM型和NDM-1型等。每一型的酶又由于基因突变导致其活性和底物不同[16-17]。（4）碳青霉烯类酶：不仅水解碳青霉烯类抗菌药，还水解其他种类的β-内酰胺类抗生素[18-19]。

PA也通过灭活酶对大环内酯类抗生素进行修饰和水解，但事实是PA对大环内酯类抗生素天然耐药。

2.2 抗菌药作用靶点发生变异

药物作用靶点的变异有多种形式。（1）结构基因突变导致抗菌药的作用靶点变异，影响与抗菌药的结合作用。例如青霉素结合蛋白（PBPs）、拓扑异构酶、核糖体蛋白、16S rRNA等生物大分子的抗菌药靶点发生变异将导致抗菌药失效[20]。DNA旋转酶的GyrA亚基氨基酸序列变异会引起喹诺酮类耐药[21]；核糖体50s亚基蛋白的变异将导致对大环内酯类的耐药性。青霉素结合蛋白（PBPs）结构变异使β-内酰胺类抗生素被耐药。（2）可移动遗传因子使外源的与药靶蛋白同源同型的基因转移到菌细胞内并发生基因重组产生嵌合基因，表达的嵌合蛋白功能正常但失去了与抗菌药的结合作用。（3）抗菌药作用靶蛋白的过度表达补偿了被药物抑制的靶蛋白而表现耐药性。（4）抗菌药作用靶点被酶修饰而阻止抗菌药作用。PA产生16S rRNA甲基化酶，使16S rRNA的不同位点甲基化，阻碍氨基糖苷类抗生素的抗菌作用。（5）细菌摄入外源抗药基因并取代本有的非耐药基因。PBP2a是PBP2的突变体，失去与青霉素类的结合作用，但仍具有肽聚糖合成的转肽酶活性。（6）靶位保护作用，即细菌产生与抗菌药靶点相结合的保护蛋白，屏蔽抗菌药作用。

2.3 细菌细胞壁外膜通透性降低而阻止抗菌药渗入

很多抗菌药难以透过PA细胞壁外膜而形成固有耐药性。四环素类、大环内酯类、林可霉素类、多肽类、托达霉素、利福霉素类、磺胺类、硝基呋喃类和硝基咪唑类对PA没有抗菌作用，表现出天然耐药[22]。外膜孔蛋白（Outer membrane porin，Omp）是大部分内酰胺类抗生素和喹诺酮类进入细胞的唯一通道，Omp蛋白发生变异将阻塞通道而耐多药。且很多β-内酰胺类广谱抗菌药不能透过PA外膜进入细胞内而形成固有耐药性。外膜孔蛋白OprD是氨基酸进入细胞的通道，其中OprD2是亚胺培南进入细胞的唯一通道[23-24]，其变异常引起亚胺培南耐药菌株。氨基糖苷类抗生素通过细菌细胞膜寡肽转运系统运送到细胞内，如果寡肽结合蛋白（oligopeptide binding protein，OBP）发生变异或减少，细菌就产生耐药性。总之，对于PA有效的抗菌药只有部分β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素。

2.4 主动外排泵系统导致细菌的多重耐药性

细菌细胞膜表面的外排泵系统能够主动排出细胞内的有害物质，包括抗菌药、消毒剂、重金属离子等[25-26]。PA的主动外排泵系统（Active efflux pump system，AEPS）是其多重耐药的主要机制，能外排细胞内的多种抗菌药。PA有4种外排泵系统：（1）MexAB-OprM（或写作MexA-MexB-OprM）介导对β-内酰胺类抗生素的耐药[27]；（2）MexCD-OprJ介导对四环素、氯霉素、喹诺酮类、大环内酯类、结晶紫及第4代头孢菌素的多重耐药；（3）MexEF-OprN系统能够外排碳青霉烯类抗生素；（4）MexXY-OprM系统介导对氨基糖苷类、喹诺酮类及氯霉素的耐药。外排泵系统结构特点：MexA、MexC、MexE、MexX是膜融合蛋白，位于周质间隙，连结外膜蛋白（OMP）与转运子；MexB、MexD、MexF、MexY是转运子蛋白，镶嵌在细菌细胞膜中，利用跨膜质子电化学势向外排出抗菌药等有害物质；OprM、OprJ、OprN是外膜通道蛋白[28]。

2.5 生物膜的屏障作用

PA极易形成BF，使之产生泛耐药性[29]。生物膜耐药机制为：（1）BF成为渗透屏障，阻止抗菌药进入细胞内；（2）BF微环境变化，如营养和氧缺乏、代谢废物堆积、pH值、渗透压等不良影响，使细菌处于休眠或非生长状态，对抗菌药失敏而耐药[30-31]。

2.6 适应性耐药

适应不良环境变化的细菌处于非生长的休眠状态，这时细菌的各种生理生化过程停滞，生物大分子的功能关闭，不易受到有害因子的影响和损伤，这时细菌产生的耐药性就属于适应性耐药。在临床上一些顽固性致病菌潜伏在体内，难以根治，在适宜的条件下恢复活性而又致病[32-33]。

3 耐药性基因的转移与传播检测

细菌耐药性（Bacterial Resistance）是指细菌产生的对抗菌药物不敏感的现象，也称抗药性。耐药性分为固有耐药性（Intrinsic resistance）和获得性耐药性（Acquired resistance）。前者又称天然耐药性，是细菌本有的抗药性，由细菌染色体遗传，PA对多种抗菌药产生的耐药性属于固有耐药性，大环内酯类抗生素由于其脂溶性和大分子结构而不能通过细胞壁外膜而渗透进入细胞内。获得性耐药是由可移动的遗传因子质粒、噬菌体、转座子和整合子等介导的在不同菌株或种属间传播的耐药性[34]。

3.1 染色体介导的耐药基因检测

铜绿假单胞菌（PA）细胞内含有一条闭合环状的细菌染色体，上面携带有许多耐药基因，这些基因原本是PA有关生理生化的必需基因，经历突变的演化后就表现出耐药性。有些染色体耐药基因是通过转座子的转运与整合子的捕获取得的，还有些是噬菌体整合的。PA主动外排泵系统基因、DNA促旋酶基因gyrA、gyrB都在染色体上[35]。PA的MexABOprM外排泵系统作用底物广泛，如果泵蛋白基因表达增强，生成更多的外排泵，促进药物的排出，其耐药性就增大。细菌外排泵排泄细胞内的代谢废物，同样外排外来的药物，是产生多药耐药的主要原因。DNA促旋酶的gyrA基因在第83位的丝氨酸和87位的天冬氨酸发生变异，就会使喹诺酮类抗菌药与促旋酶GyrA的亲和力降低而产生耐药性。细菌染色体的各种基因突变都能使基因编码的蛋白质发生变异，以致影响细菌对抗菌药物的通透性、与药靶结合的亲合性、外排泵的开放度、修饰酶的活性等。PA细胞壁外膜的通透性很低，这是其泛耐药（XDR）的又一个主要原因。PA的外膜有一种特殊的孔蛋白OprD2，是摄取氨基酸和其他营养成分的通道，只对亚胺培南有透过性，一旦OprD2变异，关闭了通道，就表现出对亚胺培南的耐药性[36]。

3.2 质粒介导耐药基因的转移与传播检测

质粒（Plasmid）是细菌染色体外遗传物质，环状闭合的双链DNA分子，具有自主复制功能，所携带的遗传信息能赋予其宿主菌某些生物性状。根据质粒基因的主要生物学功能，把质粒分为致育质粒（F质粒，Fertility Plasmid）、耐药质粒（R质粒，Resistance plasmid）、毒力质粒（Vi质粒，Virulance plasmid）、细菌素质粒和代谢质粒等。R质粒存在于G+菌与G_菌，由耐药传递因子（Resistance transfer factor，RTF）和耐药决定因子（Resistance determinant factor，RDF）序列两部分组成。前者编码性菌毛，决定自主复制和接合转移；后者赋予宿主抗药性，含有多个转座子（Tn）或耐药基因盒（Resistance gene cassettes），构成一个耐多药基因复合体。整个自然界是一个耐药基因的储藏库，含有丰富多样的耐药基因，而多重耐药的沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌和阴沟肠杆菌等革兰阴性杆菌大量存在于人的肠道中，构成了一个耐药基因库。PA染色体耐药基因的产生源于质粒在细菌之间的转移以及质粒DNA与细菌染色体之间的交换重组。R质粒能够在同种属或不同种属的细菌间转移，造成耐药基因的广泛传播[37]。用PCR方法可以分析PA菌R质粒耐药基因的来源与传播[38-39]。

3.3 噬菌体介导的耐药基因的传播与检测

噬菌体（Bacteriophage或phage）是感染细菌、放线菌和螺旋体等原核生物的病毒，只能在活的宿主菌细胞内复制增殖。噬菌体感染细菌后其基因组（一条双链DNA分子）整合入细菌染色体并随之复制扩增（噬菌体的溶源化），在复制错误或环境影响下，溶源化的噬菌体会脱离细菌染色体并携带细菌染色体的一些基因组装成新一代的噬菌体粒子，去感染其他的细菌，这个过程就叫转导（Transduction）。转导就是噬菌体把一个细菌的DNA转移到另一个细菌染色体的过程。转导的特点是能够转移比转化作用更大的DNA片段，转移效率高，但转导具有宿主菌的特异性，转导的耐药基因只能在同种细菌间转移。转座子和整合子中的基因也可经转导进行转移[40]。

转化与转导所介导的R质粒耐药基因的转移利用的是DNA之间的同源重组，而转座子和整合子则进行非同源的基因插入或切除与重组。

3.4 转座子介导的耐药基因转移与检测

转座子（Transposon，Tn）是一类基因组中可独立移动的DNA片段，能够在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行插入或切离，又称跳跃基因（Jumping gene）。Tn不能独立复制，必须依赖所在染色体、质粒或噬菌体的复制而复制。插入序列（Insertion Sequence，IS）为序列较短的转座子，长度不超过2 kb，只编码一种转座酶，其生物学作用有：（1）作为细菌正常基因的调控开关；（2）介导F质粒的同源重组并插入到细菌染色体成为高频重组菌株；（3）作为噬菌体基因的组分。另一类序列长度在2～8 kb的大转座子，除携带与转座有关的基因序列还包含其他功能的基因，如耐药基因、重金属抗性基因、肠毒素基因、糖发酵基因等，这类转座子常称为转座子（Tn），与IS相区别。Tn两端各具有一段反向重复序列（Inverted repeat，IR），具有特异位点插入功能；其中间序列编码转座酶、抗药因子和毒力因子等。Tn转座将引起被插入基因的突变，并引入一个或多个抗药基因。Tn携带的抗药基因在细菌染色体和质粒之间或质粒之间转移，且不需要基因间的同源配对[41]。Tn宿主广泛，可使耐药基因在G+菌与G-菌之间广泛转移和传播。常见的携带耐药基因的转座子如Tn1、Tn2、Tn3携带Ap（氨苄西林）耐药基因；Tn4具有Ap、strSM（链霉素）、SU（磺胺）、Hg2+、Ble（博来霉素）的耐药基因；Tn5、Tn6、Tn681含有Kan（卡那霉素）耐药基因；Tn7携带TMP（甲氧苄氨嘧啶）、str的抗药基因；Tn9具有Cam（氯霉素）耐药基因；Tn10具有Tet（四环素）耐药基因；Tn551、Tn903携带Em（红霉素）耐药基因[42]。

3.5 基因盒-整合子系统介导的耐药基因转移和传播

整合子（Integron）是一段具有独特结构和独立功能的基因组序列。一个整合子由5’保守端（5’-conserved segment，5’-CS）、3’ 保 守 端（3’-CS）和二者之间的可变区（Variable region）3部分组成。5’-CS是整合子的基本结构，包括整合酶基因（Integron integrase，intI）、附着位点（attI）和启动子（P）。3’-CS的结构序列因整合子的种类不同而变化。可变区是基因的移动区，能够捕获不同种类和数量的基因盒。基因盒（Gene cassette）是一个开放阅读框（ORF），能被整合酶（IntI）整合到整合子或从整合子切除的可移动基因单元。在G-菌中，许多抗菌药基因以基因盒的形式存在于整合子的可变区。基因盒与整合子构成了细菌基因组中基因克隆与表达的完整结构，称作基因盒-整合子系统，能够携带多个不同的耐药基因盒。整合子自身无移动性，常整合在质粒、转座子、噬菌体或细菌染色体上，捕获耐药基因盒。根据整合子的移动性，将其分为两类：（1）移动性整合子（Mobile integron），又叫抗性整合子（Resistance integron，RI），即插入在细菌可移动遗传因子（质粒、转座子与噬菌体等）上的整合子，携带的基因盒多与抗药性有关，主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子。（2）超级整合子（Super integron，SI），又称染色体整合子（Chromosomal integron，CI），是整合在细菌染色体上的整合子，除了抗药基因盒，还携带毒素、血凝素、脂蛋白等致病基因。CI随细菌的繁殖垂直传递基因盒基因，主要是Ⅳ类整合子。PA基因组包含Ⅰ、Ⅲ类整合子，Ⅰ类整合子携带多种耐药基因盒，包括β-内酰胺酶、喹诺酮类（qnr）、甲氧苄啶、广谱氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素类和四环素类等抗生素的耐药基因盒，从而产生耐多药性。Ⅲ类整合子只携带抗碳青霉烯类的β-内酰胺酶blaIMP基因。整合子通过捕获多个耐药基因盒使细菌产生多重耐药性（Multi-drug-Resistance），是临床多重耐药株出现的主要原因[43-44]。

3.6 细菌通过转化吸取耐药基因

转化（Transformation）是指细菌从环境中摄入DNA序列并经过重组整合进细菌染色体的过程。自然界遍布死亡破碎的细菌细胞，释放出大量断裂的DNA序列分子，其中包含抗药基因，易被其他活细菌摄取。PA菌的细胞壁外膜极其严密和闭封，不易被DNA分子透过，但当其进行细胞分裂等活动处于敏感状态时就容易摄入抗药基因，再通过同源重组整合入其基因组[45]。

总之，细菌染色体、质粒、转座子、整合子和噬菌体等都可能成为细菌耐药基因形成与转移的载体。基因在不断的变异过程中产生新型耐药基因。整个自然界是一个耐药基因的储藏库，细菌产生新型耐药基因的基因突变是无穷的[46]。耐药基因通过质粒、噬菌体、转座子、整合子等可移动遗传因子转移和传播。抗菌药的使用只杀灭了病原菌，难以根除耐药基因。抗菌药的滥用只消灭了敏感菌而选择了耐药菌，从而使得耐药基因广泛流传[47]。

4 结语

新的耐药基因不断产生，耐药菌株层出不穷，这给感染性疾病的防治带来了极大的困难和挑战。在现代生物医学空前发展的背景下，耐药菌感染性疾病的防治却成了难题。抗菌药的滥用选择了耐药菌，因此除了合理使用抗菌药外，耐药菌的防治还需要不断开发新的治疗方法。用宏基因组学方法筛查肠道和环境微生物中的耐药基因可以为预测致病菌抗药性的发展趋势提供数据保障。化学药物防治病原菌难以持久，研发疫苗、抗菌肽和噬菌体[48-49]等生物防治法将是感染性疾病防治的最优选择。