白色念珠菌脂肪酶研究进展

2020-01-07张黎明黄孝天

生物化工 2020年2期

张黎明，黄孝天

（南昌大学医学部微生物学教研室，江西南昌 330006）

1 脂肪酶的蛋白结构和功能

1.1 脂肪酶的分子结构

白色念珠菌脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是细胞外水解酶，分泌24 h后在37 ℃、pH为7的环境中具有最大活性[1]。从结构上讲，脂肪酶呈现α/β水解酶的典型折叠，由8个β折叠（β1～β8）形成的中央结构和6个α螺旋（αA～αF）相互连接。脂肪酶的活动中心由3种氨基酸组成：丝氨酸，天冬氨酸或谷氨酸和组氨酸，属于丝氨酸蛋白酶类。在水性介质中，大多数脂肪酶通过水/脂质界面发挥作用，称为界面活化现象。催化部位包埋在分子中，表面被α-螺旋环肽覆盖形成螺旋盖状的覆盖，起保护作用，是两亲性结构，“盖子”的外表面相对亲水，内表面则相对疏水。由于脂肪酶与油-水界面的缔合作用，导致“盖子”张开，活性部位暴露，使底物与脂肪酶结合能力增强，底物较容易地进入疏水性通道而与活性部位结合生成酶-底物复合物。“盖子”的两亲性质及其特定的氨基酸序列对于脂肪酶的活性和特异性也可能是重要的[2-4]。

1.2 脂肪酶的功能

脂肪酶的催化机理基于4个阶段组成的负载交换系统。在底物结合后，丝氨酸的羟基在脂质酯键上发生亲核攻击，导致键的断裂并在脂肪酸和亲核丝氨酸之间形成中间体。然后，释放出醇，水分子攻击过渡中间体的酯键，从而产生第二次亲核攻击，导致脂肪酸的释放和催化中心的再生[4]。该催化过程具有双重功能，不仅会生成重要的分子作为真菌生存的营养来源，而且可以对细胞壁和组织造成破坏，在宿主入侵中也起着关键作用[5-7]。

2 白色念珠菌脂肪酶的编码基因及其表达

2.1 白色念珠菌脂肪酶的编码基因

WernerH[8]首先描述了念珠菌致病菌株中的脂肪酶活性。1997年，FuY等[9]分离出白色念珠菌中第一个克隆的脂肪酶基因，名为Lip1。2000年，Hube等[10]报道了该脂肪酶基因家族（Lip2～Lip10）9个新成员的存在，这些成员已被克隆和鉴定，与脂肪酶基因Lip1有很高的相似之处。10个脂肪酶基因的开放阅读框都在1 281～1 416 bp，蛋白质编码高度相似，氨基酸序列达到80%相同。Lip蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基，保守的N-糖基化位点和类似的疏水性。除了LIP7，所有LIP都具有编码N-末端的信号序列。

白色念珠菌脂肪酶基因存在于4种不同的染色体上：1、6、7和R。根据其在氨基酸水平上的同源性，可以将脂肪酶同工酶分为3个亚群。第一亚群由Lip1、Lip2、Lip3、Lip6和Lip10组成，显示出至少74%的相似性。第二亚群由具有至少68%相似性的脂肪酶Lip4、Lip5、Lip8和Lip9组成。第一亚群的成员在1号染色体上编码，而第二亚群的成员除了位于6号染色体的Lip4外，其他都位于7号染色体上。Lip7与其他脂肪酶成员之间差异最大，不编码任何信号肽，并且是唯一存在于R染色体上编码的基因。这种广泛的染色体重排使真菌能够应对不同的条件，这表明脂肪酶基因家族的表达是白色念珠菌适应其宿主的机制[11]。

2.2 白色念珠脂肪酶基因差异表达

白色念珠菌的10个脂肪酶基因，在实验模型和患者样品中的定殖过程中存在差异表达，并且受感染阶段和感染部位的影响很大[12]。用逆转录-聚合酶链反应研究了这一多基因家族在实验感染和口腔念珠菌病患者样本中的表达模式。研究结果表明，在系统性念珠菌病小鼠模型中，个别脂肪酶基因受到不同程度的调控，一些成员表现出持续表达，而另一些成员则表现出短暂表达甚至沉默。脂肪酶基因表达谱与感染阶段有关，而与器官定位无关。在口腔念珠菌病的实验模型中也检测到脂肪酶基因表达的这种时间调节，对8名鹅口疮患者的研究也显示了差异表达，在所有样品中均表达了Lip1和Lip9，表明与定居场所相关，未检测到Lip10，并且在50%的样品中检测到Lip4、Lip5和Lip8转录本[13]。采用小鼠消化道定植（盲肠内容物）和口胃感染黏膜念珠菌病模型，研究了白念珠菌脂肪酶基因家族（Lip1～Lip10）的表达。在制备的盲肠内容物和受感染粘膜组织（胃、硬腭、食道和舌头）样本中几乎每个都表达Lip4～Lip8，这表明这些基因产物具有维持功能。相比之下，在受感染的胃组织中一致检测到的Lip1、Lip3和Lip9在受感染的口腔组织中基本上是检测不到的。此外，Lip2在盲肠内容物中表达一致，但在受感染的口腔组织中检测不到，表明Lip2可能对消化道定植很重要，但对口腔感染不重要[14]。

3 白色念珠菌脂肪酶的致病性

3.1 为白色念珠菌提供营养

突变株（ΔLip8/ΔLip8）ΔLip8/ΔLip8的白色念珠菌在含脂培养基YNB-Tween40和一种用于肠道外营养治疗的含脂质溶液中，生长能力均显著降低，说明脂肪酶可能在消化脂质以获取营养方面起着重要作用[15]。这在全肠外营养环境中尤其重要，特别是在脂肪注射的情况下，脂肪酶的产生将促进白念珠菌获取营养[16]。

3.2 对宿主细胞的损伤作用

Maria等[17]利用白色念珠菌释放的细胞外脂肪酶直接与单核细胞作用，分别用25 U和100 U的脂肪酶作用单核细胞，并在6 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h监测细胞损伤，发现脂肪酶对正常单核细胞的作用取决于孵育时间和剂量。高剂量的脂肪酶能够诱导细胞质的LDH(乳酸脱氢酶)释放和核形态的严重变化，从而支持真菌脂肪酶直接与这种哺乳动物细胞相互作用并产生损害。Gácser等[18]构建了近平滑念珠菌CpLip1和CpLip2的敲除突变体，并评估了这些脂肪酶在真菌病发病机理中的作用。这些脂肪酶参与内皮细胞和人口腔上皮中LDH的释放和细胞凋亡的诱导，表明这些酶也参与宿主细胞的损伤。与两种巨噬细胞（J774.16和RAW264.7Mf）共培养后，两种巨噬细胞均能有效杀死近平滑念珠菌，然而与野生型相比，脂酶阴性细胞的杀灭率更高。Paraje等[17,19]使用来自白色念珠菌的纯化脂肪酶，提供了有关该脂肪酶对免疫系统细胞和宿主实质细胞直接作用的重要证据，并报道了这种脂肪酶具有诱导高浓度有氧化合物产生和细胞凋亡的能力。在使用白色念珠菌突变体ΔLip8/ΔLip8感染的念珠菌病小鼠模型中，与亲本菌株感染相比，肾脏感染数量低于亲本菌，这清楚地表明Lip8是感染的关键毒力因子[15]。

Graciela等的研究表明全身性白色念珠菌感染会导致肝脏细胞脂肪变性[20]。该研究报道了一个有趣的结果：对应于脂肪储存的单核细胞中，细胞质强烈空泡化，在更长的孵育时间和更高的脂肪酶剂量下都增加了细胞的空泡变性。脂质积累是真核病原体细胞中脂肪酶的生理功能。在对肝细胞的体外实验中，脂肪酶就具有直接损伤肝细胞并诱导脂肪沉积的能力，真菌代谢物与白色念珠菌的同时孵育产生加和效应，在与白色念珠菌进行长时间培养（12 h）后，才能看到少量的脂肪堆积，而灭活的白色念珠菌则不会产生这种现象。这些结果证明了这种真菌因子具有诱导体外脂肪变性的能力[17]。

Castillo等[21]评估了分离自口腔损伤患者的念珠菌病原菌中脂肪酶的活性，结果为非典型扁平苔藓、恶性病变（鳞状细胞口腔癌）、慢性念珠菌病和健康的粘膜。所有病变的临床分离株均具有脂肪酶活性，但未检测到健康对照组的脂肪酶活性。与从其他口腔病变中分离出的分离物相比，口腔癌分离物显示出更高的脂肪酶活性，表明具有更大的致病潜力。

4 白色念珠菌脂肪酶作为潜在的药物靶点

以念珠菌脂肪酶为药物作用靶点的抗真菌治疗仍然是一个挑战。目前条件致病真菌，尤其是白色念珠菌感染引起的疾病增加，而抗真菌药物种类少且耐药能力的增强对临床治疗提出了严峻的挑战[22]。在体外感染模型中，使用了重构的人体组织模型来模拟白色念珠菌和近平滑念珠菌感染，ASA（阿司匹林）的治疗浓度降低了组织损伤。在富含橄榄油的脂质基本培养基中，白色念珠菌、近平滑念珠菌和近平滑念珠菌脂肪酶阴性（ΔcpLip1-2/ΔcpLip1-2）突变体的生长，进一步评估了ASA的脂肪酶抑制作用，发现治疗浓度的ASA抑制了野生型真菌的生长。脂肪酶抑制剂奎宁和依贝内酯B抑制念珠菌的生长，减少了念珠菌对组织的损伤[23]。