LncRNA与肿瘤铂类耐药关系的研究进展

施辰, 曹海霞, 娄芮, 徐陈欣, 冯继锋

1 LncRNA概述

70%的人类基因组能够被转录,但只有不到2%的转录产物具有编码蛋白质的功能,其余的98%均为非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA),根据核苷酸序列的长度,ncRNA可分为短链ncRNA(short/small ncRNA)和长链ncRNA(long ncRNA,LncRNA),二者之间并没有特别严格的界限,仅以ncRNA核苷酸序列的长度来区分,一般将长度大于200个核苷酸的ncRNA定义为LncRNA[1]。LncRNA分布广泛,在动物、植物、酵母甚至病毒中均发现有LncRNA存在,其功能几乎涉及到生物体生理及病理的全部生物学过程,既能调节细胞的增殖、分化及代谢等生理过程,也参与调节机体的各种病理过程,如癌症、糖尿病、免疫病、阿尔茨海默病等[2]。尽管在过去20多年里,也有关于LncRNA的一些报道,但高通量测序技术的发展才使得从基因水平研究LncRNA成为可能[3]。为了更深入地开展LncRNA的相关研究,了解其功能及作用机制,科学家们根据LncRNA在基因组中所处的位置及背景,将其分为5种类型,即正义、反义、双向、基因内及基因间LncRNA[4-5]。

目前关于LncRNA相关功能的研究中,最深入的便是其在癌症中的作用。在正常的生理条件下,LncRNA的表达受到严格调控。相反,在许多癌症的发生发展中均伴随着LncRNA的异常表达,它们既可以作为原癌基因促进肿瘤的生成,亦可作为抑癌基因来抑制肿瘤细胞的增殖、迁移等[6]。因此,LncRNA可以成为癌症的特异性标志物和治疗靶点[7]。一项对膀胱癌患者组织进行芯片分析的研究结果发现,有3 324个LncRNA发生了异常表达,且这些LncRNA表达与健康对照组相比,差异倍数≥2,其中有110个LncRNA表达差异非常明显,与健康对照组相比,差异倍数≥8。进一步实验证明,LncRNA TNXA、CTA.134P22.2、CTC.276P9.1及KRT19P3变化与芯片数据高度一致[8]。另一项研究发现LncRNA H19在膀胱癌组织中高表达,上调LncRNA H19可加速膀胱癌细胞的转移,其机制可能是LncRNA H19通过与果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(EZH2)结合后激活Wnt/β连环蛋白(β-catenin)信号通路,并下调钙黏附蛋白(E-cadherin)的表达来促进膀胱癌的转移[9]。除了膀胱癌,LncRNA H19在前列腺癌中还可以通过LncRNA H19-miR675轴调节转化生长因子β诱导蛋白(TGFβI),从而抑制前列腺癌的转移[10]。研究发现LncRNA AFAP1.AS1在食管腺癌及其癌前病变巴雷特食管中都呈高表达,而当小干扰RNA将LncRNA AFAP1.AS1沉默时,则能抑制食管腺癌细胞的分化、侵袭及转移[11]。总之,LncRNA是真核生物转录本中非常重要的组成部分,它在机体的生理及病理过程中均发挥着极其重要的作用。

2 铂类药物

铂类药物是一类非特异性细胞周期抗肿瘤药物,目前在临床治疗中应用中较多的有顺铂、卡铂、奥沙利铂。这类药物可以通过影响肿瘤细胞DNA的结构和功能发挥抗癌作用[12]。铂类药物进入细胞后先发生解离失去酸根负离子,再结合两分子的水,形成带正电荷的水合铂。这个带正电荷的水合铂可以和细胞内的DNA、RNA和蛋白质结合。其中DNA嘌呤碱基上的N7位点又是铂类抗肿瘤药物的关键靶点,从而形成链内交联、链间交联和DNA-蛋白质分子间交联,其中又以链内配对交联为主,所有的交联都会使DNA链发生局部扭转或解旋,进而造成DNA损伤,最终导致肿瘤细胞周期阻滞或细胞凋亡[13-14]。由于上述铂类药物与细胞内各组分的非特异性结合以及铂类药物损伤DNA、诱导凋亡机制的多样性,使得肿瘤细胞对铂类药物的耐药性可以经由多种途径发生,肿瘤细胞的耐药性也成为影响化疗效果和肿瘤根治的主要障碍[15]。肿瘤耐药分为原药耐药(primary drug resistance,PDR)和多药耐药(multidrug resistance,MDR),PDR指肿瘤细胞对已使用过的药物产生了耐药作用,而MDR指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药后,又对其他不同作用机制的药物也产生了耐药,MDR可出现在多种恶性肿瘤疾病中,如卵巢癌、胃癌、大肠癌、肺癌等。而铂类抗肿瘤药物结构上的相似性使得耐药性或交叉耐药性成为限制其临床应用的主要障碍之一[14]。铂类药物耐药的途径主要有4种:① 药物跨膜转运降低,使药物在肿瘤细胞内的蓄积减少;② 细胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)和金属硫蛋白(metallothionein,MT)浓度增加,使铂类药物代谢失活;③ DNA损伤修复功能增强,肿瘤细胞忽略铂类药物导致的DNA损伤而继续增殖;④ 细胞凋亡功能受抑制,肿瘤细胞无法通过凋亡通路被杀灭[16-17]。

3 LncRNA参与肿瘤铂类药物耐药的机制

肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药性是化疗失败的主要原因之一。不管是先天性耐药还是后天获得性耐药,细胞内信号通路的异常激活均与肿瘤耐药性密切相关[18]。近年研究发现,LncRNA可在染色体修饰、转录以及转录后水平方面广泛地对基因的表达进行调控,并参与X染色体沉默、基因组印记、核内运输和转录激活、转录干扰等调控过程,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡,并导致肿瘤的发生、发展和侵袭迁移等一系列活动[19]。LncRNA对肿瘤耐药的相关作用机制较复杂,主要有以下几类。

3.1 LncRNA通过调控信号通路引起细胞周期的改变造成耐药 研究发现,LncRNA可以通过影响肿瘤细胞周期造成耐药[20]。比如在骨肉瘤组织中LncRNA HOTTIP明显高于正常组织;用不同剂量的顺铂处理骨肉瘤细胞,HOTTIP高表达促进细胞进入S期,促使细胞对顺铂耐药;其机制为HOTTIP通过激活Wnt/β-catenin途径来增加骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性[21]。LncRNA HOTAIR是第1个发现的具有反式调节转录作用的LncRNA,其在多种恶性肿瘤中高表达。有研究发现与亲本肺腺癌细胞系(A549)相比,HOTAIR在顺铂耐药的肺腺癌细胞系(A549/DDP)中的表达显著上调,因此HOTAIR可作为肿瘤转移及预后的预测因子[13,22]。HOTAIR亦可通过激活Wnt/β-catenin信号通路使细胞对顺铂耐药,而敲除HOTAIR则对Wnt/β-catenin信号通路产生抑制,使细胞周期停滞在G0期,细胞的增殖能力下降,使化疗敏感性增强[22-23]。另一项研究报道指出LncRNA MEG3在顺铂耐药的肺腺癌细胞系A549/DDP中的表达明显下降,升高MEG3的表达可抑制肺腺癌细胞增殖,其机制也是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路引起肿瘤细胞发生周期阻滞,从而增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感度,抑制肿瘤的进展[24]。

3.2 LncRNA参与调控肿瘤细胞凋亡 一些肿瘤化疗药物是通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的生长,所以凋亡调节失控也可引起耐药的发生。LncRNA可以通过上调Bcl-2、核因子-κB(NF-κB)、凋亡抑制蛋白(IAP)等促生存因子获得凋亡抗性,或者抑制半胱氨酸蛋白酶(caspase)、p53等抑癌基因表达产生耐药性。研究发现复发性铂类耐药卵巢肿瘤的LncRNA HOTAIR表达水平高于原发性卵巢肿瘤,并且HOTAIR的上调可以诱导卵巢癌发生铂类耐药。其机制是HOTAIR使DNA损伤修复持续激活,促进NF-κB表达、白细胞介素-6(IL-6)分泌以及活化细胞周期检测点激酶1(CHK1)-p532-p2途径,从而抑制细胞凋亡,产生化疗耐药性。在DNA损伤修复期间,驱动NF-κB-HOTAIR轴正反馈环级联有助于增加细胞凋亡和化疗敏感性。顺铂耐药卵巢癌细胞(SKOV-3/DDP、A2780/DDP)比顺铂敏感细胞(SKOV-3和A2780)的LncRNA PVT1过表达。已知PVT1与原癌基因MYC共同位于染色体8q24,两者的表达与人类原发肿瘤的产生有关。PVT1过表达使转化生长因子-β1(TGF-β1)、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表达水平降低,肿瘤细胞凋亡比例减少,细胞活力升高造成耐药,而敲低PVT1可以使TGF-β1、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,肿瘤细胞凋亡比例增加,细胞活力降低,进而逆转顺铂耐药细胞株的顺铂耐药性[25]。可见PVT1通过调节细胞凋亡途径参与卵巢癌顺铂耐药性的产生。此外在泌尿系统肿瘤研究中发现,膀胱癌细胞中的LncRNA UCA1表达减少,会抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,降低顺铂敏感性,而UCA1的过表达增加了膀胱癌细胞的化疗敏感性,其机制是UCA1和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)启动子结合,激活miR-196a-5p表达,miR-196a-5p可以直接靶向p27kip1,诱导细胞凋亡,从而参与顺铂耐药[26]。

3.3 LncRNA作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)发挥耐药作用 近年来研究发现,LncRNA能以“海绵”吸附方式与miRNA竞争性结合并调节细胞的生物学行为,因此此类LncRNA被称为ceRNA,在肿瘤的药物敏感性中发挥重要的作用[20,27]。LncRNA UCA1可以通过竞争性结合miR-204-5p调控靶基因CREBl/BC12/RAB22A,从而介导MDR[28]。另外在顺铂敏感的骨肉瘤细胞中,LINC00161通过竞争性结合和上调四肽重复的干扰素诱导蛋白(IFIT2)表达,促进细胞凋亡,增强化疗敏感性,而LINC00161在顺铂耐药细胞中表达下调,则使骨肉瘤细胞产生顺铂耐药性[29]。

3.4 LncRNA通过调节耐药相关基因及蛋白参与肿瘤细胞耐药 多药耐药基因1(multidrug resistance gene1,MDR1)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance related proteins,MRP)参与了多种肿瘤的铂类耐药[30]。LncRNA可以通过靶向调节这些耐药相关基因参与肿瘤对铂类药物的耐药机制。据文献报道INK4基因座的反义LncRNA ANRIL在顺铂耐药的胃癌细胞(BGC823/DDP)中表达升高,且ANRIL的表达与MRP的表达呈正相关,通过敲低ANRIL可以抑制MDR1和MRP1的表达,从而抑制胃癌耐药性的进展[31]。此外研究发现LncRNA PVT1在对顺铂耐药的胃癌组织和耐药细胞系中呈高表达,敲除PVT1可逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性,qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,PVT1表达的上调可以促进MDR1的表达,从而导致胃癌细胞对化疗耐药的发生[32]。

3.5 LncRNA通过影响药物转运体系干扰药物代谢

药物外排系统的改变是肿瘤耐药机制中最常见的一种。由于药物流出的增加,导致细胞内药物浓度低于细胞杀伤阈值从而引起肿瘤耐药。ATP结合盒超家族成员(ATP-binding cassette,ABC)是影响化疗药物敏感性的重要药物转运体,这些蛋白通过利用ATP水解的能量将细胞内的药物泵出到细胞外,从而降低细胞内药物的浓度使细胞产生耐药性,尤其对于MDR的影响极为突出[33]。而LncRNA可以通过调节ABC超家族蛋白的表达从而调控肿瘤化疗耐药。例如LncRNA MRUL是与胃癌MDR相关的一种LncRNA,有报道指出MRUL可以调节ABC家族中的细胞膜P-糖蛋白(P-gp)表达从而发挥增强子样的作用,其可促进P-pg的表达导致相关化疗药物外排增多、摄入减少,从而促进MDR形成,而抑制MRUL可提高化疗药物的敏感性[34]。

3.6 LncRNA可以调节上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) EMT是指与基底膜相连的上皮细胞丧失细胞极性和细胞-细胞间黏附能力,成为间充质细胞,这种生物学性状的改变使细胞获得迁移和侵袭能力[35]。多种肿瘤细胞经过化疗后会发生EMT,这种适应性变化的产生使肿瘤细胞发生继发性耐药。近年来肿瘤干细胞被认为是对药物高度耐药的一类细胞,且EMT与肿瘤干细胞的生物学表型有着密切联系[36-37]。LncRNA UCA1位于人类染色体19p13.12,总长1439 bp,包含3个外显子,UCA1可通过调节EMT影响肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感度[38]。又有研究指出HOTAIR可以诱导肺癌细胞发生EMT,其机制是HOTAIR可以促进EZH2过表达来抑制SCLC细胞中与EMT相关的基因表达[39]。又如在肾细胞癌中HOTAIR是组蛋白脱甲基酶JMJD3的正向调节因子,其可以促进靶基因Snail上调,而Snail能促进EMT,所以HOTAIR也可以通过组蛋白修饰来介导EMT[40]。

4 小结与展望

多种LncRNA在化疗敏感性和耐药性细胞中的表达不同,它们通过调节基因表达直接或间接影响化疗效果,其引起的铂类药物耐药过程往往不止一种机制被激活,抑制单一的耐药信号通路往往不能使化疗效果恢复到正常水平,因此克服铂类药物的耐药性可能需要同时针对多种耐药机制才能起作用。LncRNA在癌症中的特异性表达使其可以作为癌症诊断和预后的标志物以及新的治疗靶点,给未来的肿瘤治疗带来了新希望。