乳腺癌肝转移的机制及治疗

王竞翊,马哿,夏添松,王水

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,约占女性新发肿瘤病例的30%[1]。随着诊断技术的发展和治疗方法的提高,乳腺癌患者的预后已明显改善。早期乳腺癌患者5年总生存率超过90%,而晚期乳腺癌患者5年总生存率急剧下降至26%[2]。乳腺癌发生远处转移是治疗失败和死亡的主要原因之一,常见转移部位有骨、肺、肝和脑[3]。肝脏是实体肿瘤常见的转移部位,是乳腺癌第三常见的转移部位。乳腺癌肝转移(breast cancer liver metastasis,BCLM)可表现为腹部不适、恶心、厌食等,转移灶压迫肝脏或肝脏结构被破坏时可表现为肝区疼痛、肝肿大、腹水、黄疸等。

关于恶性肿瘤转移的机制,1889年Paget提出了“种子与土壤”学说[4],该学说提出了“土壤”(即转移靶器官,如骨、肺、肝、脑等)可以为“种子”(即肿瘤细胞)的转移提供适宜的生长环境,强调了转移是肿瘤细胞与远处靶器官微环境相互作用的结果。Kaplan等[5]提出了“转移前微环境”的概念,指在“种子”定植前,先诱导“土壤”进行一系列改变,营造一个适宜转移的微环境。Semenza等将乳腺癌血行转移过程分为:乳腺癌细胞局部浸润、渗入循环系统、随循环系统转移至靶器官、渗出循环系统、在靶器官中定植并形成转移灶[6]。对乳腺癌转移机制的研究,主要集中在乳腺癌骨转移和肺转移,而对肝转移的分子机制尚未完全阐明。同时,肝组织较肺、骨组织有其结构特点,可能是影响乳腺癌发生肝转移的重要因素之一。因此,阐明BCLM发生发展的机制,有助于寻找有效的诊断及治疗靶点,对临床治疗具有重要的指导意义。现对乳腺癌肝转移的机制及治疗进展进行综述。

1 乳腺癌肝转移过程

1.1 在肝组织中形成转移前微环境 原发肿瘤在发生转移前能够先诱导特定的器官组织部位形成一个有利于肿瘤细胞转移的微环境,即转移前微环境,其特征包括免疫抑制、炎症反应、血管生成及通透性增强、淋巴管生成、组织重构等。由于免疫监视的存在,肿瘤发生发展的每一步都可能被抑制。CD8+T细胞、NK细胞和单核细胞均可在不影响原发肿瘤生长的情况下抑制肿瘤转移[7]。在转移前微环境的形成过程中,多种细胞参与了抑制抗肿瘤免疫反应,如骨髓衍生抑制细胞、M2型巨噬细胞、Treg细胞等[8]。因此,对原发灶和转移灶来说,消除免疫抑制至关重要。乳腺癌细胞在肝组织定植前,通过分泌多种因子使表达血管内皮生长因子受体1的造血干细胞(vascular endothelial growth factor receptor 1+,VEGFR1+)迁移至肝组织中,形成一个富集纤维连接蛋白的微环境,这种微环境有助于循环中的乳腺癌细胞停留在肝组织中。Kaplan等通过使用抗体或直接移除小鼠骨髓中VEGFR1+细胞来抑制VEGFR1+的功能,发现可以明显抑制转移前微环境的形成,进而抑制转移,而重新给予VEGFR1+细胞可以促进转移[9]。此外,VEGFR1+细胞表达VLA-4,肿瘤特异性生长因子可以上调成纤维细胞中VLA-4的配体,进而提供一个有利于乳腺癌细胞定植的环境[10]。

外泌体是细胞间相互沟通的重要载体,多种细胞在正常状态及病理状态下均可分泌外泌体。越来越多的证据表明,外泌体参与乳腺癌的远处转移,是转移微环境的重要调控因子。外泌体中的相关成分具有选择富集性,尤其是蛋白和非编码RNA,呈现出较高的敏感性和特异性。在乳腺癌发生肝转移前,乳腺癌细胞分泌的外泌体先在肝组织中聚集,与肝细胞膜融合,使微环境发生趋向性改变,营造一个适于乳腺癌细胞定植的环境[11]。已有文献报道,肿瘤来源的外泌体表达的整合素参与了肿瘤细胞定植部位的选择[12]。外泌体的蛋白质组学显示出独特的整合素表达谱,其中外泌体整合素αvβ5与肝转移有关。乳腺癌细胞外泌体表达的整合素αvβ5通过结合肝脏Kupffer细胞参与转移前微环境的形成,靶向αvβ5可以减少乳腺癌肝转移[12]。

慢性炎症也参与了乳腺癌肝转移前微环境的形成。既往认为中性粒细胞在肿瘤发生发展中是惰性的,而越来越多的研究表明,其在肿瘤分化的早期阶段就能调控中性粒细胞,中性粒细胞具有表型异质性,在转移过程中具有双重作用,可以促进或抑制转移[13]。癌细胞来源的粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)是乳腺癌肝转移发生发展中必要因素,但不足以动员未成熟的低密度中性粒细胞(immature low-density neutrophils,iLDNs)促进肝转移。相反,成熟的高密度中性粒细胞可抑制肝转移[14]。通过对高、低密度中性粒细胞的转录组学和代谢组学分析发现有许多代谢途径参与乳腺癌肝转移,特别是iLDNs。iLDNs通过参与线粒体生成ATP的过程增加生物学能力,在缺乏营养的条件下仍能执行中性粒细胞促进转移的功能,包括中性粒细胞胞外陷阱形成(neutrophil extracellular traps,NETosis)。NETosis是中性粒细胞的一个重要功能,可促进乳腺癌肝转移。在没有葡萄糖的情况下,iLDNs通过分解代谢谷氨酸和脯氨酸来支持线粒体的代谢,并继续形成NETosis[15]。转移前中性粒细胞群体的代谢过程表现出高度的适应性,有助于肝转移的形成。

1.2 在肝组织中定植 肝组织的结构有其特殊性,肝窦内皮细胞为有孔内皮,缺乏内皮基底膜,有助于肿瘤细胞从循环系统外渗入肝组织[16]。此外,窦状的内皮细胞有助于进行血管内物质交换,进而促进肿瘤细胞的迁移。乳腺癌细胞也可通过内皮细胞进入Disse间隙,直接与肝细胞接触[17]。肝组织结构的特殊性对于乳腺癌细胞的在肝组织的定植有重要作用。

在分子水平上,肿瘤细胞可以通过特定的黏附分子黏附在肝窦内皮细胞上,如钙黏蛋白-2(cadherin-2)。钙黏蛋白在乳腺癌的发生中促进上皮细胞间质化,并参与局部浸润或远处转移[18]。与正常组织相比,乳腺癌组织中紧密连接蛋白Claudin-2表达降低,且与乳腺癌分级呈负相关,而Claudin-2在乳腺癌肝转移组织中的表达量比其他组织中转移灶的表达量高[19]。Tabariès等[20]首先证明了Claudin-2在乳腺癌细胞与肝细胞间的相互作用,以及在乳腺癌肝转移中的重要作用。他们发现,Claudin-2可以促进乳腺癌细胞与肝细胞间的相互作用,促进细胞在肝组织中定植,而乳腺癌细胞或肝细胞中Claudin-2表达水平的降低会减少细胞间的相互作用。

活化的肝星状细胞介导的肝纤维化也是乳腺癌肝转移发生的重要机制[21]。Hu等[22]发现肝组织中的松弛素(relaxin,RLN)是一种抗纤维化肽,可作为一种天然的调节因子,使活化的肝星状细胞失活并抑制肝纤维化。他们通过纳米颗粒来传递编码RLN的质粒DNA,优先靶向转移灶内的乳腺癌细胞和活化的肝星状细胞,RLN表达量增高的微环境不利于发生乳腺癌肝转移。这一结论在乳腺癌肝转移模型中得到了验证,RLN基因治疗显著抑制乳腺癌肝转移进展并延长了生存期。

1.3 在肝组织中转移灶的形成 肿瘤细胞在靶器官定植后,脉管系统的形成可促进定植的肿瘤细胞形成转移灶。结直肠癌是目前研究最多的肝转移模型,其在肝组织中的生长方式有:纤维型、膨胀型、替代型[23]。在乳腺癌肝转移中,替代型是最常见的生长模式,表现为一种非血管生成的模式,保留了间质。以往替代型生长模式的早期被认为是休眠状态,而乳腺癌细胞在晚期获得了有助于生长的脉管系统。

除了脉管系统生成外,肿瘤细胞在形成转移灶的过程中自身会出现恶性生物学行为的衍进。E-Cadherin表达减少是发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的标记之一,常被认为侵袭性增强。然而,E-Cadherin表达增加的乳腺癌细胞促进肝定植,这可能与间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)有关。其他研究表明,N-钙粘蛋白(N-Cadherin)[24]、纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)[25]、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)[26]等可以促进肿瘤细胞增殖、转移,抵抗E-Cadherin的抑制作用。EMT也与干细胞特性有关[27]。CD44+/CD24low/-的乳腺癌细胞有较强的干细胞特性,高表达CD44的细胞有较强的黏附性、侵袭性、抑制凋亡、促进转移等[28]。Erin等[29]发现转移到肝组织的乳腺癌细胞高表达CD44,提出乳腺癌肝转移的趋向性可能由肿瘤干细胞决定。乳腺癌患者,尤其是肝转移患者的血清中可以检测到干细胞标志物CD44,主要是CD44 v5和v6,同时,高表达CD44 v6的乳腺癌患者更可能发生肝转移[30]。

低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)通过调节与乳腺癌转移有关靶基因的转录,参与基底膜的重建、代谢、血管生成、细胞黏附等,在肝脏中形成转移灶[31-32]。HIF可直接激活赖氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)抑制肝转移,而通过骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转录因子TWIST等促进肝转移[33-34]。OPN可以促进间质细胞转化为成纤维细胞,转移灶内成纤维细胞的表面标记物也明显增多,如α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、趋化因子CXCL12等[35-36]。微环境中的趋化因子与肿瘤细胞表面的趋化因子受体相互作用,如CXCR4-CXCL12/SDF-1[37],以及间质细胞释放的CCL5在肝转移的过程中也发挥了重要作用[38]。此外,炎症反应也参与了乳腺癌细胞在肝组织中的定植。乳腺癌细胞进入肝脏后引起炎症反应,引起Kupffer细胞释放肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),上调血管内皮细胞黏附受体选择素E(E-selectin)的表达等等,进而改变肝脏微血管系统,有利于定植的细胞形成转移灶[39]。

2 乳腺癌肝转移的动物模型

良好的动物模型在科学研究、创新等方面有着不可替代的作用和价值。研究乳腺癌转移的动物模型有很多种,包括自发性、诱发性和移植性[40-41],但大部分较难实现肝转移。心内注射和脾内注射模型易发生肝转移,但是这些模型可能因继发部位形成转移或因脾脏切除致免疫力降低,难以在注射部位形成肿瘤。为了满足对肝转移模型的需求,Goddard等[42]在BALB/c小鼠的门静脉直接接种鼠源性乳腺癌细胞,将肿瘤细胞富集在肝脏部位,明显提高了模型的有效性和实用性。

将来源于患者的肿瘤组织块接种到免疫缺陷小鼠或大鼠体内,即PDX模型(patient-derived xenograft),也被应用于乳腺癌肝转移的研究,这一模型高度模拟、还原了乳腺癌异质性、微环境、病理分型等。Vishnoi等[43]通过分离三阴性乳腺癌患者血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),注射到免疫缺陷小鼠中,建立CDX模型(cell-line-derived xenograft),并通过流式细胞术、免疫表型分析、基因组测序等方法比较CTCs和肝细胞,发现597个与三阴性乳腺癌肝转移有关的基因,其中22个基因可用于预测患者预后的液体活检标志物。建立理想的肿瘤动物模型可以提供一个很好的替代方案,是抗肿瘤研究中很重要的一个环节。

3 乳腺癌肝转移的临床表现、诊断及治疗

乳腺癌肝转移患者早期病灶隐匿,随着病情进展,可出现腹部不适、腹胀、腹痛、恶心、厌食、背痛、体重减轻等表现。大部分患者可出现肝脏肿大,肝功能指标异常,但较少出现黄疸、腹水。血清白蛋白浓度正常是预示生存期延长的最佳因子,而出现腹水则预示生存期缩短,有腹水的患者更有可能死于肝功能衰竭[44]。

乳腺癌肝转移在影像学上有多种表现形式。超声检查主要表现为低回声结节,“牛眼样”结构。因乳腺癌患者术后接受内分泌治疗或化疗,部分患者会出现脂肪肝。在脂肪肝的背景下,转移灶多表现为不均质低回声,转移灶和脂肪肝之间的回声差异较为明显。CT和MRI具有较高的分辨率,能充分展示病变的范围、结构等,更有助于乳腺癌肝转移的诊断。乳腺癌肝转移患者的非典型表现,包括脂肪肝样、富血供型转移、肝硬化性转移、弥漫性肝窦内转移、大叶性萎缩、包膜退缩等[45]。

乳腺癌肝转移患者若不进行任何治疗,生存时间为4～8个月,有效的治疗可以改善患者的预后,适当延长生存期[46]。乳腺癌具有很强的异质性,不同分子分型的乳腺癌其治疗方法和预后明显不同。转移性乳腺癌也一样具有异质性,约45%的乳腺癌转移患者出现原发灶的免疫组化结果与转移灶的免疫组化结果不一致[47]。因此,乳腺癌患者发生转移后需要先检测转移部位免疫组化,再根据结果选择内分泌治疗、化疗、靶向治疗等。

乳腺癌肝转移患者行肝脏转移瘤切除术一直有争议。AGO建议晚期和转移性乳腺癌患者,如果肝内转移灶可以完全切除,或肝外没有转移灶,或Luminal型乳腺癌且对内分泌治疗有效,或HER2阳性乳腺癌患者年龄< 50岁,转移灶< 5 cm,可考虑行手术治疗[47]。Arena等[48]基于小样本统计出,能够手术切除的乳腺癌肝转移,无论选择哪种手术方式,如扩大切除、肝叶切除或区段切除术,手术治疗的效果均优于非手术治疗。此外,还可选择局部治疗方法,如放疗、介入治疗。

近年来,免疫治疗取得了一定的进展。目前治疗肿瘤最成功的免疫方法是免疫检查点阻断和过继性T细胞疗法(adoptive T-cell therapy,ACT)。免疫检查点阻断是通过注射抗体,在患者体内激活T细胞。而ACT是从患者的血液或肿瘤中取T细胞,在体外培养能识别肿瘤的T细胞,随后回输至患者体内。Zacharakis等[49]在晚期乳腺癌患者应用ACT,成功地调整了1例患者的免疫系统进而消除了乳腺癌细胞。另外,PD-1/PD-L1免疫类药物,如O药(Opdivo)、K药(Keytruda)、T药(Tecentriq)、I 药(Imfinzi)、B药(Bavencio),对表达PD-L1的晚期乳腺癌患者有一定的治疗效果。针对发生肝转移的晚期乳腺癌患者,在单药治疗不理想的情况下,可以考虑联合治疗,如全身治疗和局部治疗联合、化疗和免疫治疗联合等。

4 小结

乳腺癌肝转移是一个多步骤、多因素影响的过程。乳腺癌肝转移过程主要分为在肝组织中形成转移前微环境、定植、再形成转移灶,每一过程有其独特的机制,但亦互相影响。乳腺癌肝转移的诊断主要根据临床表现和影像学检查,治疗以手术切除为主,可联合化疗、介入治疗等。免疫治疗是乳腺癌肝转移的治疗的发展方向,但还需要更多的研究来进一步验证。