Box-Behnken设计优化蔓荆子总黄酮DES提取工艺研究

王连红，张建梅，都玲玲，姚明志，陈甘牛，刘瑞珍，孙太元*

（1.烟台市林业科学研究所，山东 烟台264013；2.宁海街道办事处，山东 牟平264015；3.烟台市森林保护站，山东 烟台264013）

蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)或蔓荆(Vitex trifoli L.)的干燥成熟果实[1]，功能疏散风热、清利头目，为山东道地药材之一。单叶蔓荆不仅具固沙改土、蓄水保墒等功能[2-5]，同时还具有药用价值[6.7]，在《国家重点保护野生药材物种名录》中，单叶蔓荆已被列为国家Ⅲ级濒危保护植物[8.9]。蔓荆子含有黄酮、挥发油、萜类、生物碱等成分[10]，尤其是其总黄酮显示出显著的抗氧化、抗肿瘤、镇痛、消炎、抗菌等活性。蔓荆子黄酮类以蔓荆子黄素为主，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶剂，因此一般采用乙醇提取总黄酮[11]。

低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）是由氢键供体和氢键受体组合而成的混合物，熔点远低于其组成物，且不易挥发、安全无毒[12]。作为一类新型绿色溶剂，DES在天然产物提取分离领域备受关注，研究应用日益广泛。

本文以常用的氯化胆碱为氢键供体组份配制一系列DES用于提取蔓荆子总黄酮，以总黄酮提取率为评价指标经Box-Behnken（BBK）实验设计优化DES提取工艺，并通过测定DPPH清除率考察所得提取物的抗氧化活性，为工业化生产蔓荆子提取物提供依据，并为其进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蔓荆子均采自烟台市芝罘区幸福林场沿海防护林地。芦丁（南京景竹生物科技有限公司,HPLC≥98%,批号：JZ16041802），其他试剂均为分析纯。

UV-Vis分光光度计；METTLER PL203型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LEGNED MICRO 17高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司），DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），Milli-Q超纯水处理系统（美国Millipore公司）。

1.2 总黄酮含量测定方法

将蔓荆子药材分别粉碎过40目筛，准确称取药物粉末0.1g，置10mL容量瓶中，按照试验条件进行提取，提取液经0.22μm滤膜过滤。精密吸取上述滤液2.5mL置10mL试管中，加5%NaNO20.3 mL摇匀、放置6 min，加 10%Al(NO3)30.3 mL摇匀、放置 6 min，加 10%NaOH 4 mL摇匀、放置 20 min，在510 nm处测定吸光度(A)，并代入标准曲线（C=0.1186A+0.022，R2=0.9999）计算总黄酮浓度 C[11]。

1.3 DES种类对蔓荆子提取液中总黄酮含量的影响

准确称取蔓荆子粉末1g置于离心管中，加入15mL DES，40℃温浸持续搅拌 3.5h，3700rpm/min 离心5min，取上清液2 mL经适当稀释后采用1.2项下方法测定总黄酮含量。DES种类对提取液中总黄酮含量的影响结果见图1。

图1 DES种类对提取液中总黄酮浓度的影响

1.4 BBK设计优化蔓荆子总黄酮DES提取工艺

根据预实验结果，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）三个因素，以提取液中总黄酮含量为响应值，优化提取工艺条件。BBK实验因素与水平设计见表1。

表1 BBK实验因素水平表

等高线形状和三维响应曲面可以反应出交互效应的强弱，根据二次拟合模型的响应曲面和等高线模型评价提取时间、提取温度与料液比及其交互作用对蔓荆子总黄酮提取率的影响，结果见图2。

以响应值（总黄酮提取率）最高为目标计算最优提取工艺条件。取蔓荆子粉末3份、每份1g，按最优提取条件提取，测定并计算蔓荆子总黄酮提取率，并与预测结果进行比较。

1.5 蔓荆子DES提取液DPPH抗氧化实验研究

取样品稀释液100μL加等量0.1mmol/L DPPH溶液，摇匀，孵育30min后在517nm处测定其吸光度A样品，同时测定样品溶液吸光度A对照，DPPH溶液吸光度A空白，并按照下列公式计算自由基清除率[14]。相同条件下测定VC的DPPH抗氧化活性。

清除率（%）=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100%

2 实验结果与分析

2.1 DES种类对蔓荆子提取液中总黄酮含量的影响

结果表明，氯化胆碱-乳酸体系所得提取液中总黄酮含量最高，但其溶液色泽变暗，推测该体系可能影响成分的稳定性。氯化胆碱-1.3-丁二醇的提取率次佳，因此以该体系为提取溶剂进一步研究。见表2、图1。

表2 响应中心组合试验设计及结果

2.2 BBK优化蔓荆子总黄酮DES提取工艺

使用二次方程式的数学模型对试验数据进行拟合，总黄酮提取率的数学模型：

R=-12.04275+1.63162B+0.24709A+0.33639C-5.02500*10-4AB+3.17500*10-3BC+4.34500*10-3AC-0.26010 B2-1.88098*10-3 A2-0.033243 C2,方程相关系数R2和R2Adj分别为0.9276和0.8344，说明模型拟合程度较好，回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的关系。

对响应曲面数据进行分析和显著性检验，结果见表3。由表3可知，该模型显著且失拟项无显著性，表明模型拟合程度良好、误差小。3个因素中C2、A2、B2对实验结果影响显著，且3因素影响大小依次为：A〉B〉C。

表3 回归模型系数显著性检测及模型方差分析

图2 三种因素交互作用对总黄酮提取率影响的响应面与等高线

由图2可知，各因素交互影响的响应面曲率不大、等高线均为椭圆形，说明提取温度、提取时间和料液比的交互作用对蔓荆子总黄酮提取率均有一定的影响、但不显著。

经软件预测所得的最优提取条件为时间3.12h、温度77.09℃、料液比1:10.25，此时预测的总黄酮提取率为1.75%。验证实验所得蔓荆子总黄酮提取率为1.68%（RSD=1.33%），与预测值基本一致。表明上述模型的预测准确度较高。

2.3 蔓荆子DES提取液DPPH抗氧化实验研究

根据实验结果，蔓荆子DES提取液的DPPH自由基清除率为84.76%±0.23，VC的自由基清除率为91.28%±0.58，蔓荆子DES提取液清除DPPH自由基的能力较强。

3 结论

本文借助BBK设计优化了DES温浸提取蔓荆子总黄酮工艺条件为：料液比1:10.25条件下77.09℃温浸提取3.12h，此时总黄酮提取率约为1.7%，体外抗氧化试验表明所得提取物的DPPH清除率高达84.76%±0.23。DES温浸提取操作简便、提取率高、提取物抗氧化效果显著，是一种较为理想的生产蔓荆子提取物的新方法。本文为进一步开发和改进蔓荆子总黄酮的生产和应用提供了理论依据。