不同抗冻剂对冻藏鲢鱼滑品质特性的影响

黄建联

（1 福建安井食品股份有限公司 福建厦门 361022

2 农业农村部冷冻调理水产品加工重点实验室 福建厦门 361022）

鱼糜制品是水产品加工的重要形式之一，2018年我国鱼糜制品加工总量达145.6万t，居水产品加工量的第3位，仅次于水产冷冻品和干腌制品[1]。鱼滑以鲜鱼为原料，经采肉后加入食盐搅打至黏稠状态，加入淀粉、蛋清等辅料调味后进行简单成型制成的鲜食类鱼糜制品[2]。随着市场需求的急剧扩增以及火锅餐饮业的快速发展，以手工加工为主的鲜肉鱼滑满足不了市场的供应需求，冷冻鱼滑鱼糜制品的规模化生产十分迫切。目前市场上也已出现以墨鱼滑为主的冷冻海水鱼滑，而淡水类冷冻鱼滑产品较少，主要原因是淡水鱼肌肉蛋白抗冻稳定性较差，在冻藏过程中易发生冷冻变性[3]，亟需研究抗冻剂对淡水鱼滑品质的影响，以达到最大程度地保护冻藏鱼滑品质的目的。

糖（醇）类抗冻剂是目前防止肌原纤维蛋白变性的主要抗冻剂，主要包括蔗糖、山梨醇、海藻糖和乳糖醇等二糖及其醇类化合物[4]。研究认为糖类通过改变内部结合水的状态和性质来间接地起抗冻作用，其作用大小与羟基配位有关[5-6]。近几年关于糖（醇）类化合物抗冻剂的研究集中在低甜度和低热量型抗冻剂抗冻效果方面。海藻糖具有良好的抗冻特性且热量较低。Zhou等[7]发现8%的海藻糖能有效延缓罗非鱼鱼糜的蛋白变性过程，维持肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性和蛋白质的溶解度。Nopianti等[8]探究了乳糖醇、海藻糖和葡聚糖等5种低甜度甜味剂对鱼糜抗冻效果的影响，结果发现这些甜味剂均能对鱼糜蛋白产生不同程度的抗冷冻变性作用。此外，葡甘露聚糖、甲壳素及蛋白水解液等也具有一定的抗冻效果[9-11]。以上文献均是以冷冻鱼糜为研究对象，而关于抗冻剂对预凝胶鱼滑类鱼糜制品冻藏过程中的保护效果研究鲜有报道。

本研究探究海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇3种抗冻剂对冻藏过程中鲢鱼鱼滑品质的保护作用。通过单因素和配方均匀设计试验，得出复配抗冻剂的最适添加量，并验证复配抗冻剂的效果，旨在为糖（醇）类在鱼滑类鱼糜制品抗冻保护中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲢鱼，购于无锡华润万家超市，体重为（2000±200） g；食盐，江苏盐业集团；聚乙烯肠衣，福建安井食品有限公司提供；塑料小皿（圆柱体），广州昕迪实验器材有限公司；氯化钾，三羟甲基氨基甲烷（Tris），顺丁烯二酸（Mal），乙二胺四乙酸（EDTA），国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；二硫代硝基苯甲酸（DTNB），Sigma公司，为分析纯。

1.2 仪器与设备

MO-385型莫菲绞肉机，佛山桃花岛电器有限公司；实验斩拌机，福建安井食品有限公司；手动灌肠机，双马机械公司；双槽恒温水浴锅，南京先欧仪器制造公司；MK3型全自动酶标仪，美国Thermos Scientific公司；D-78532型高速冷冻离心机，德国Hettich公司；TA.XTPlus物性分析仪，英国SMS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼滑的制备 新鲜鲢鱼去头、鳞、皮及内脏后将鱼体切块，用绞肉机将鱼肉绞碎筛去鱼骨。用以鱼肉质量5倍体积的4℃以下去离子水将所采鱼肉漂洗3次，再用含0.3%NaCl的去离子水（4℃以下）漂洗1次，每次漂洗5 min，静置3 min后倾去水及表面杂质[12]。用纱布挤压脱水至水分为80%左右为止。以600 g为一份进行斩拌，先空斩2 min，再加2.5%的食盐斩拌3 min，期间加冰水将鱼浆水分含量调至85%，制成鱼滑。斩拌过程中每间隔40 s停止斩拌，翻动样品避免局部过热，整个斩拌过程中斩拌腔体温度控制在10℃以下。将鱼浆灌入圆柱体塑料小皿，制备成鱼滑样品，将样品放入-20℃冷柜中冻藏，以冻藏时间0，1，3，7，10，15，25，40，60，90 d 为测试时间点。在测试时间点取样进行4℃空气解冻，进行各指标的测定。

1.3.2 凝胶强度的测定 凝胶强度的测定方法参考Petcharat等[13]的方法，并稍作修改。用灌肠机将鱼滑样品充入聚乙烯肠衣（直径30 mm）中，制成长度为20 cm的鱼肠。将鱼肠放入90℃恒温水浴锅中加热30 min后取出，置于冰水中使其快速冷却至室温，然后置于4℃下冷藏24 h。测试前将鱼肠取出，剥去肠衣后切成高25 mm的圆柱体，待其温度上升至室温后，用TA-XT2i质构仪测定其凝胶强度（采用球形探头P/5S，测定速度1.00 mm/s，下压距离15 mm）。鱼滑的凝胶强度用破断强度（g）与凹陷深度（cm）的乘积表示，每组至少测定6个平行样品，取均值。

1.3.3 盐溶性蛋白含量的测定 在每个测试时间点取出鱼滑样品，按照Lian等[14]的方法稍作修改。从中取出10 g样品加入100 mL低盐缓冲液（0.05 mol/L KCl，0.02 mol/LTris-Mal），然后 1 500 r/min高速匀浆2 min，将匀浆液在9 000 r/min、4℃条件下离心10 min。后取沉淀加入100 mL高盐缓冲液（0.6 mol/L KCl，0.02 mol/L Tris-Mal），充分匀浆后置于4℃中盐提1 h，之后再在4℃条件下以9 000 r/min离心10 min。将上清液用4层纱布过滤除去肌肉结缔组织和肌膜后，得到肌原纤维蛋白溶液，盐溶性蛋白含量采用BCA试剂盒测定[15]，标准曲线如图1所示。

图1 蛋白质量浓度标准曲线Fig.1 The standard curve of protein concentration

1.3.4 Ca2+-ATPase活性的测定 参考Wang等[16]的方法进行酶活性的测定，计算式为：

活性=（A-B）/T/c蛋白

式中：A——1 mL反应液生成的磷酸含量（μmol）；B——空白值（μmol）；T——反 应时 间（min）；c蛋白——肌原纤维蛋白浓度。

1.3.5 活性巯基含量的测定 参考Cao等[17]的方法。取1 mL肌原纤维蛋白溶液于20 mL试管中，加入9 mL 0.2 mol/L的Tris-Mal缓冲液（pH 7.0），其中含有2%的SDS和10 mmol/L的EDTA，将其充分混匀后从中取出4 mL，加入0.04 mL的0.1%的DTNB溶液（pH 8.0）。然后40℃水浴加热30 min，冷却到室温后测定其在412 nm处的吸光值。

计算公式为：

SH（mol/105g） =[（A×n）/（M×c蛋白）]

式中：A——吸光值；n——稀释倍数；M——试剂的摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm）；c蛋白——肌原纤维蛋白浓度，空白组以0.6 mol/L的KCl溶液代替。

1.3.6 单因素试验 选择海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇作为抗冻剂添加到鱼滑样品中，在空斩和盐斩后再斩拌3 min，置于-20℃冷柜中冻藏。设定添加量梯度为 1.5%，3.0%，4.5%，6.0%，7.5%，9.0%，10.5%[18]，以不添加抗冻剂的样品作为参照。以凝胶强度、盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、甜度为指标，研究上述糖（醇）对鲢鱼滑的防冻效果，综合各指标确定一个合适的添加量范围。其中，甜度单因素试验采取0～10分打分制，5分为适中水平，7.5分为比较不能接受水平，感官评定员对样品感受到的甜度越强，得分越高。以不添加抗冻剂的鱼滑样品和添加10.5%蔗糖的样品作为参照，由10位感官评定员进行评定。

1.3.7 配方均匀设计 试验配方均匀设计表的建立：在单因素试验确定了总的添加量百分比后，采用DPS数据处理系统软件定向优化得到如表1所示[19]。

表1 配方均匀设计表Table1 Formulation uniform design

1.4 统计分析

采用Excel 2013和SPSS 19.0进行图表绘制和统计学分析，数据形式以平均±标准差表示。数据间差异显著性（P＜0.05）分析采用ANOVA方法。

2 结果与分析

2.1 抗冻剂添加量对凝胶强度的影响

各抗冻剂添加量对鲢鱼滑凝胶强度的影响如图2所示。在新鲜状态下，添加了抗冻剂的样品的凝胶强度有不同程度的提高，随着添加量的增加，各样品的凝胶强度呈缓慢上升趋势，后趋于稳定，说明过多的添加量对鲢鱼滑的凝胶强度没有促进作用。其中，麦芽糖醇和山梨醇的添加量超过6.0%时，凝胶强度出现下降趋势，推测可能是过量的抗冻剂导致体系离子浓度升高，使Ca2+-ATPase活性降低，从而导致肌球蛋白交联度降低[20]。当添加量低于4.5%时，添加海藻糖组的凝胶强度与对照组相比显著提高（P＜0.05）。冻藏30 d后，含3%海藻糖样品的凝胶强度仍维持在较高水平，鱼滑样品的凝胶强度为334.3 g·cm，而新鲜状态样品的凝胶强度为374.2 g·cm。对照组和添加量为1.5%的抗冻剂组凝胶强度均较低，而山梨醇的添加量为4.5%左右时，凝胶强度显著提高，由此可见，当山梨醇添加量达到4.5%时，能有效防止鱼滑蛋白变性，随着添加量的增加，组间差异不显著（P＞0.05）。同样，麦芽糖醇的添加量为3%左右时，凝胶强度明显增加，说明了3%的海藻糖和麦芽糖能有效防止鱼滑蛋白变性，继续增加添加量，凝胶强度上升不明显，反而出现下降趋势。

2.2 抗冻剂添加量对盐溶性蛋白含量的影响

抗冻剂添加量对鲢鱼滑盐溶性蛋白含量的影响如图3所示。在冻藏过程中，盐溶性蛋白分子由于二硫键、疏水键、氢键的形成而聚集变性，因而其盐溶性会下降[21]。从图3可以看出，抗冻剂的添加量对于新鲜状态下鱼滑样品的盐溶性蛋白含量没有影响，其含量稳定在50～60 mg/g之间。30 d冻藏期结束后，添加3.0%～4.5%海藻糖和麦芽糖醇的鱼滑样品的盐溶性蛋白含量较空白对照组有明显提高，且与对照组有显著差异（P＜0.05），增加添加量，其盐溶性蛋白含量无明显变化，这表明3.0%～4.5%的添加量已经能够较好地防止鲢鱼滑蛋白质冷冻变性；山梨醇添加量为4.5%时盐溶性蛋白含量较高，与对照组相比有显著差异（P＜0.05），说明4.5%左右的山梨醇足以有效延缓鱼滑蛋白变性，继续增加添加量，盐溶性蛋白含量的上升趋势不明显。这与Pan等[22]的研究结果类似。

图3 鲢鱼滑盐溶性蛋白含量随抗冻剂添加量的变化Fig.3 Changes in salt extractable protein of silver carp slide with different cryoprotectants contents

2.3 抗冻剂添加量对Ca2+ -ATPase活性的影响

肌球蛋白分子头部具有Ca2+-ATPase活性位点，其活性能反映出肌球蛋白的变性程度[23]。抗冻剂添加量对鲢鱼滑Ca2+-ATPase活性的影响如图4所示。新鲜状态的鱼滑肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性稳定在 0.233～0.263 μmol/min/g间，冻藏30 d后，添加不同量抗冻剂样品的酶活出现了不同程度的变化。其中，海藻糖和麦芽糖醇的添加量为3.0%～4.5%时，Ca2+-ATPase活性显著提高 （P＜0.05），说明该添加量范围能有效防止鱼滑蛋白变性。随着添加量的提高，增幅不明显，组间差异不显著（P＞0.05），当海藻糖和麦芽糖醇的添加量超过6.0%时，Ca2+-ATPase活性甚至出现下降；当山梨醇添加量为4.5%时，Ca2+-ATPase活性明显提高，说明4.5%的添加量能有效延缓鱼滑蛋白变性，与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。随山梨醇添加量的提高，Ca2+-ATPase活性的上升趋势不明显，但较低添加量时高，此结果与前面冻藏过程中鱼滑中盐溶性蛋白含量变化相一致。

图4 鲢鱼滑Ca2+ -ATPase活性随抗冻剂添加量的变化Fig.4 Changes in Ca2+ -ATPase activity of silver carp slide with different cryoprotectants contents

2.4 抗冻剂添加量对甜度的影响

山梨醇、麦芽糖醇和海藻糖添加量百分比为1.5%，3.0%，4.5%，6.0%，7.5%，9.0%，10.5%，通过感官评定的方法对鱼滑甜度进行打分。试验以空白鱼滑样品和添加10.5%蔗糖样品作为参照，由10位感官评定员进行评定，甜度感官分数越高说明甜度越大。从图5中看出山梨醇在1.5%～4.5%范围内甜度感官得分小于5分，麦芽糖醇在1.5%～3.0%范围内甜度感官得分小于5分，海藻糖在1.5%～6.0%范围内甜度感官得分小于5分，甜度处在一个合适的水平。当添加量为7.5%时，麦芽糖醇的甜度明显，开始不能被接受，此时其它两种抗冻剂甜度仍处在较低水平。

图5 鲢鱼滑甜度随抗冻剂添加量的变化Fig.5 Changes in sugariness of silver carp slide with different cryoprotectants contents

综合抗冻剂单因素试验结果，发现海藻糖和麦芽糖醇在添加量为3.0%～4.5%范围内时，山梨醇添加量在4.5%～6.0%范围内时抗冻效果较好，继续增大添加量效果不显著（P＞0.05）；甜度感官评定单因素试验结果表明，7.5%的添加量是一个临界点，综合考虑以上试验结果，选择6.0%作为抗冻剂的总添加量百分比，进行配方试验。

2.5 配方均匀设计试验结果

以6.0%为总添加量百分比，按照表1中所示抗冻剂的复配配比进行试验，以凝胶强度为指标，冻藏30 d。从表2中可以看出，0 d和30 d两列数据中，添加了复配抗冻剂后，鲢鱼滑样品的凝胶强度比空白对照组样品均有显著提高（P＜0.05）。对于0 d的样品，以组4和组9的配方比例复配海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇，获得的凝胶强度最高，分别达到344.6 g·cm和351.1 g·cm，与其它样品组有显著性差异（P＜0.05），而空白对照组的凝胶强度仅为273.4 g·cm；冻藏30 d后，不同组样品的凝胶强度出现了不同程度的下降。其中，空白对照组的凝胶强度降到176.2 g·cm，降幅达35.8%，组4和组9的样品的凝胶强度分别下降到289.6 g·cm和295.2 g·cm，降幅分别为12.8%和15.9%。此外，组4和组9的配方比例具有一个共同点，即海藻糖、麦芽糖醇、山梨醇比例接近，分别在16%～21%，10%～22%和60%～70%范围内。综合上述试验结果，选择组4中的配方作为添加到鲢鱼滑中的复配抗冻剂的配方：海藻糖16%，麦芽糖醇22%和山梨糖醇62%。

表2 复配抗冻剂的配方均匀设计结果Table2 Results of formulation uniform design of mixed cryoprotectants

2.6 复配抗冻剂的稳定性

确定了复配抗冻剂的配方后，需要对其抗冻效果进行验证，研究其对鲢鱼滑冻藏抗冻效果的稳定性，因此本研究以不添加抗冻剂的样品为空白对照，测定了添加复配抗冻剂的鲢鱼滑的凝胶强度、盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、活性巯基含量在冻藏过程中的变化。如图6所示，随着冻藏时间的延长，鲢鱼滑的凝胶强度随之下降，但抗冻剂组的样品凝胶强度始终高于空白组。其中，空白组下降程度较大，在前7 d下降最为显著（P＜0.05），而添加了复配抗冻剂的样品下降幅度较小。冻藏期结束后，抗冻剂组鲢鱼滑的凝胶强度为156.3 g·cm，空白对照组鲢鱼滑的凝胶强度为89.3 g·cm，说明抗冻剂的加入可有效保持冻藏过程中鲢鱼滑的凝胶强度。随着冻藏时间的延长，鱼滑的盐溶性蛋白含量也随之下降。其中未添加抗冻剂的空白对照组下降幅度较大，前7 d下降最明显（P＜0.05），随后下降幅度减小，在同一时间测得的抗冻剂组的盐溶性含量均比空白组的高，这说明在-20℃冻藏过程中，复配抗冻剂的添加可以较好地抑制蛋白质的变性。

随着冻藏时间的延长，鱼滑的Ca2+-ATPase活性也随之下降。其中未添加抗冻剂的空白组下降幅度较大，前20 d下降最明显（P＜0.05），随后下降幅度减小，而抗冻剂组整体下降幅度较小，仍能保持较高的活性。结果说明，在-20℃冻藏过程中，鱼滑Ca2+-ATPase活性会因蛋白变性逐渐减小，而复配抗冻剂的添加可以较好抑制蛋白质的变性。蛋白在冻藏过程中发生氧化变性，巯基会氧化形成二硫键，因此造成巯基含量的降低[24]。随着冻藏时间的延长，鲢鱼滑的巯基含量也随之下降。其中未添加抗冻剂的空白对照组下降幅度较大，前25 d下降最显著（P＜0.05），随后下降幅度减小；抗冻剂组下降幅度较小。在同一时间同一冻藏温度下，抗冻剂组的巯基含量均比空白对照组的高。结果说明，-20℃冻藏过程中，鱼滑巯基含量会因蛋白变性逐渐减小，而复配抗冻剂的添加可以较好抑制蛋白质的变性。

综上，通过稳定性试验证明该复合抗冻剂能有效抑制鱼滑的品质劣变，延缓鱼滑蛋白质的冷冻变性。目前许多研究也发现通过多种抗冻剂的复配，能实现比使用单一抗冻剂更好的抗冻保护效果[25-26]。

图6 鲢鱼滑冻藏指标随冻藏时间的变化Fig.6 Changes in frozen indicators of silver carp slide in different frozen time

3 结论

通过海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇的单因素试验，获得6.0%的总添加量百分比，在此添加量百分比时解冻加热后的鲢鱼滑具有较高的凝胶强度，且其盐溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性也较对照组高；通过对3种抗冻剂进行配方均匀设计试验，得出最佳的抗冻剂配方为：海藻糖16%，麦芽糖醇22%和山梨糖醇62%，冻藏稳定性试验证明该配方能有效抑制鱼滑冻藏过程中的品质劣变，延缓蛋白质的冷冻变性。