葡聚糖及其糖基化修饰对白鲢鱼糜凝胶特性的影响

尤 娟 姜雪英 尹 涛 胡 杨 黄琪琳 熊善柏 *

（1 华中农业大学食品科技学院 武汉 430070

2 国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心 武汉 430070）

鲢鱼是我国淡水鱼中分布最为广泛的鱼类，全国产量从1999年的306.2万t增长到2016年的450.7万t[1]。由于鲢鱼产量大且价格低廉，所以已成为淡水鱼鱼糜的主要加工原料。为防止鱼糜在冻藏过程中发生冷冻变性，导致鱼糜综合品质下降，一些糖及糖醇类物质被作为冷冻变性保护剂添加到鱼糜中[2]。葡聚糖是一种高分子质量的中性多糖，具有甜度低、热量小的特点，可代替蔗糖等高热量糖而用于鱼糜的抗冻保护。鲁耀彬等[3]比较了葡聚糖和传统商业抗冻剂对冻藏过程中肌原纤维蛋白的冷冻保护效果，得出小分子质量的葡聚糖对淡水鱼及相关制品的冷冻保护效果较好。另有研究者[4-6]报道葡聚糖具有增强人体免疫力、抗辐射、抑菌等功能。余文熙等[7]在鲭鱼鱼丸中添加葡聚糖以增强其质构特性并起到防腐保鲜的效果。将葡聚糖添加在鱼糜及其制品中具有多方面的优势。然而，加工鱼糜制品的过程中需经加热等工序，在此过程中葡聚糖可与蛋白质发生糖基化反应。

糖基化反应是由蛋白质的游离氨基和还原糖的羰基发生的非酶促褐变的化学反应[8]。葡聚糖与许多蛋白质如乳清蛋白[9]、猪血蛋白[10]、大米蛋白[11]、荞麦蛋白[12]的糖基化反应对它们功能特性的影响已有较多的研究。在水产领域，张爱荣[13]、芦晶等[14]、陈欣[15]及尤娟[16]等研究了糖基化反应对鱼肉肌原纤维蛋白溶解性、乳化性等功能特性的影响。然而葡聚糖的糖基化反应对鱼糜制品凝胶特性的影响还较有限。邓海萍等[17]研究了3种电荷多糖添加物（壳聚糖、葡聚糖、卡拉胶）对鲢鱼糜凝胶结构的影响，没有注意到发生的糖基化反应以及该反应对鱼糜凝胶特性的影响。本文以白鲢鱼糜为原料，研究葡聚糖在鱼糜凝胶制备过程中的糖基化反应程度及糖基化反应对鱼糜凝胶特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

新鲜鲢鱼，购自华中农业大学农贸市场。葡聚糖，分子质量10 000 u，购于上海源叶生物科技有限公司。其它试剂均属于分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 鱼糜凝胶的制备

参考郭秀瑾等[18]的方法，将新鲜鲢鱼脊背白肉采下后搅碎，加入4倍体积的冰水搅拌5 min后静置10 min，倾去液体，重复3次，得沉淀。再向沉淀中加入4倍体积0.5%NaCl溶液，倾去液体，重复两次。将沉淀以5 000 r/min离心10 min，得到鱼糜，控制鱼糜含水量在80%。将鱼糜放入斩拌机中斩拌，依次进行空斩2 min、加入一定比例的葡聚糖后斩2 min，再加入2.5%盐斩拌3 min后制得鱼糜与葡聚糖混合物，其中葡聚糖的添加量按照肌原纤维蛋白干基质量的0倍、0.5倍、1倍、2倍加入。将混合物抽真空除去空气后利用制肠机灌进肠衣，再将不同糖比例的肠放入40℃分别反应0，2，4，6，8 h，然后在 40℃水浴 1 h 后再于 90℃水浴0.5 h制成鱼糜凝胶，冷藏备用。

1.3 pH的测定

将上述样品的初始pH调至8.2，糖基化反应的发生会引起体系pH的变化，故采用梅特勒pH计测定糖基化反应后体系的pH。

1.4 反应中间产物和褐变程度的测定

将糖基化反应后样品加一定量水捣碎后以5 000 r/min离心10 min，取上清液，利用721型-紫外分光光度计分别在420 nm和294 nm下测定其吸光值。294 nm下的吸光值即为糖基化反应中有紫外吸收的中间产物，420 nm下的吸光值即为糖基化反应的褐变程度。

1.5 凝胶强度的测定

参考郭秀瑾等[18]的方法，将制备好的鱼糜凝胶切成高2 cm的柱状体，用TA-XT Plus质构仪的穿刺模式进行测定。

1.6 微观结构的观察

参考马瑶兰等[19]的方法，采用高倍扫描电镜，在10 000倍的放大倍数下，观察鱼糜凝胶的网络结构。

1.7 数据统计与处理

试验重复3次，每次试验根据要求做3个或5个平行，应用Excel（2012）作图。对采集的试验数据采用 SAS 8.0统计分析 （SAS 8.0，Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行相关性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 糖基化反应时间和糖比例对鱼糜凝胶pH的影响

通过图1可以看出，未加葡聚糖的鱼糜凝胶pH值在反应2 h后，没有显著性降低；而添加了葡聚糖的鱼糜凝胶pH值随着糖基化反应时间的延长逐步显著降低（P＜0.05）。糖基化反应是由蛋白质上游离的氨基与糖的羰基反应，氨基被消耗且反应过程中产生了甲酸、乙酸等有机酸，因此反应的pH逐步降低[16]。由此可以说明鱼糜和葡聚糖的混合物在40℃下发生了糖基化反应，导致整个体系的pH逐步降低，且随着反应时间的延长，糖基化反应程度越高。当葡聚糖添加比例越大，经过反应后鱼糜凝胶pH值降低的越多，说明糖基化反应越显著。You等[20]在研究5种糖（木糖、半乳糖、葡萄糖、葡聚糖、低聚异麦芽糖）与水溶性蛋白的糖基化反应时得出了相一致的结果。由此可以得出，反应时间与葡聚糖添加比例对糖基化反应均有影响。在试验条件内，加热时间的增长和加糖比例的增大均会加速糖基化反应的进行。加糖量越高，游离的可被利用的羰基就越多，反应物接触越多；加热时间越长，基团反应就越彻底，糖基化反应就越剧烈[8]。

2.2 糖基化反应时间和糖比例对鱼糜凝胶褐变程度和中间产物的影响

420 nm吸光值表征了Maillard反应中有色基团的生成量，使体系呈现出褐色，是反应Maillard反应进程的一个重要指标[20]。图2反应了糖基化反应时间和葡聚糖添加比例对鱼糜凝胶褐变程度的影响。随着反应时间的延长，没有添加葡聚糖的鱼糜凝胶在420 nm下的吸光值没有显著性变化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的鱼糜凝胶在420 nm下的吸光值均随着反应时间的延长而升高。对于蛋白与葡聚糖比例分别为2∶1和1∶1的鱼糜凝胶，其420 nm吸光值在前4 h内显著性升高（P＜0.05），而后没有显著性变化（P＞0.05）。可能是蛋白和葡聚糖在前4 h反应剧烈，4 h后可以反应的底物逐渐减少，反应减慢，褐变速率变小。而蛋白与葡聚糖比例为1∶2的鱼糜凝胶，420 nm下吸光值显著上升，当反应时间达到8 h后吸光值略有下降，可能是因为反应时间过长，糖基化反应进入第3个阶段，生成了不易溶解的产物[21]，导致吸光值略有降低。当反应时间相同时，2∶1和1∶1两个比例鱼糜凝胶的吸光值没有显著性差异，而蛋白和糖的比例为1∶2时鱼糜凝胶吸光值高于其它比例的凝胶，说明1∶2比例的鱼糜凝胶褐变程度较大，糖基化反应程度较高。

图1 糖基化反应时间和葡聚糖比例对鱼糜凝胶pH的影响Fig.1 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on pH of surimi gel

图2 糖基化反应时间和葡聚糖比例对鱼糜凝胶褐变程度的影响Fig.2 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the browning of surimi gel

在糖基化反应过程中，氨基酸和还原糖反应使得有紫外吸收峰的物质生成，且该物质可在294 nm下被检测到，因此可以用294 nm的吸光值来监测糖基化反应的程度[16]。如图3所示，糖基化反应时间为0 h的4个不同比例样品的吸光值无显著性差异（P＞0.05）。随着反应时间的延长，没有添加葡聚糖的鱼糜凝胶在294 nm下的吸光值没有显著性变化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的鱼糜凝胶在294 nm下的吸光值均随着反应时间的延长而逐渐升高。对于蛋白与葡聚糖比例为2∶1和1∶1的鱼糜凝胶，其294 nm吸光值在前2 h内显著性升高（P＜0.05），而后没有显著性变化（P＞0.05）。而蛋白与葡聚糖比例为1∶2的鱼糜凝胶，294 nm下吸光值显著上升，当反应时间达到8 h后吸光值略有下降。该趋势与其420 nm吸光值变化相一致，同样说明在2∶1和1∶1的比例下葡聚糖2 h内可能反应消耗。当反应时间相同时，糖基化的鱼糜凝胶吸光值显著高于未添加葡聚糖的鱼糜凝胶，且2∶1和1∶1两个比例鱼糜凝胶的吸光值没有显著性差异，而蛋白和糖的比例为1∶2时鱼糜凝胶吸光值高于其它比例的凝胶，说明1∶2的样品糖基化反应最为活跃。

图3 糖基化反应时间和葡聚糖比例对鱼糜凝胶糖基化反应中间产物的影响Fig.3 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the content of intermediate products of glycosylation in surimi gel

2.3 反应时间和糖比例对鱼糜凝胶强度的影响

葡聚糖添加量和糖基化反应时间对鱼糜凝胶强度的测定结果如图4所示。随着糖基化反应时间的延长，没有添加葡聚糖的鱼糜凝胶的破断力明显降低（P＜0.05），当反应时间延长至6 h后其破断力没有显著变化（P＞0.05）；而添加了葡聚糖的鱼糜凝胶的破断力在反应8 h内均没有显著性变化（P＞0.05）。说明40℃前先加热鱼糜凝胶会使得鱼糜凝胶的硬度降低，但葡聚糖的添加有利于增强鱼糜凝胶的热稳定性。Álvarez等[10]在研究猪血蛋白通过葡聚糖糖基化修饰时也得出猪血蛋白的热稳定性和乳化活性都得到提高，而凝胶强度比未糖基化的猪血蛋白降低了50%。这可能是因为葡聚糖阻碍了蛋白与蛋白之间的作用，保护了蛋白的初始结构，葡聚糖的存在降低了溶解蛋白溶液的流动性，使得蛋白处在一种相对紧凑稳定的状态，热稳定性增强[22]。在0～8 h的反应时间段里，添加葡聚糖的鱼糜凝胶破断力远小于未添加葡聚糖的鱼糜凝胶破断力，并且随着葡聚糖添加比例的增加，鱼糜凝胶在各个反应时间内的破断力均呈现显著降低的趋势。

破断力反映的是鱼糜凝胶的硬度，而凹陷深度则可反映鱼糜凝胶的弹性[19]。由图4（b）可以看出，随着糖基化反应时间的延长，未添加葡聚糖的鱼糜凝胶的凹陷深度缓慢降低，当加热时间达到6 h时显著降低；随着反应时间的延长，添加了葡聚糖的鱼糜凝胶凹陷深度没有显著性差异。在反应前4 h内，添加了葡聚糖的鱼糜凝胶凹陷深度显著低于相应时长下未添加葡聚糖的鱼糜凝胶（P＜0.05），在反应后 4 h，比例为 2∶1 添加葡聚糖的鱼糜凝胶凹陷深度相对较大。说明葡聚糖的添加和加热会减弱鱼糜凝胶网络结构的形成，可能是因为葡聚糖和鱼糜蛋白的氨基反应，减少了TGase促进的交联网络形成的可能。另一方面，葡聚糖使蛋白分子与蛋白分子之间存在较大的空间位阻，降低了二硫键或蛋白分子疏水相互作用促进的交联网络结构形成的可能[10]。

由图4（c）所示，葡聚糖添加和反应时间对鱼糜凝胶强度的影响与破断力的变化趋势较一致。随着反应时间的延长，未添加葡聚糖的鱼糜凝胶强度显著性降低（P＜0.05），反应6 h后，没有显著性变化；而添加了葡聚糖的鱼糜凝胶强度在反应的8 h内均没有显著性差异（P＞0.05）。在糖基化反应的前4 h内，随着葡聚糖的添加比例的增大，鱼糜凝胶强度显著性降低（P＜0.05）；在反应的后4 h内，葡聚糖添加比例为2∶1的鱼糜凝胶强度没有显著性变化，且高于未添加葡聚糖的鱼糜凝胶强度。说明葡聚糖的添加会导致鱼糜形成凝胶的能力下降，凝胶强度下降的原因是葡聚糖与鱼糜蛋白进行糖基化反应，反应活性越强，对于体系凝胶网络结构的改变就越大，导致凝胶网络弱化，这一结果与María等[23]研究的结果类似，即糖基化反应活性最高的多糖与蛋白质形成的复合凝胶最弱。

图4 反应时间和葡聚糖比例对鱼糜凝胶破断力（a）、凹陷深度（b）及凝胶强度（c）的影响Fig.4 Effects of reaction time and sugar ratio on the breaking force （a），penetration distance （b） and gel strength （c） of surimi gel

2.4 反应时间和糖比例对鱼糜凝胶微观结构的影响

鱼糜凝胶的微观结构是影响其凝胶强度的重要因素。图5显示了不同葡聚糖添加量及糖基化反应时间下所制得的鱼糜凝胶的扫描电子显微镜图。由图5可知，在反应前2 h内，未添加葡聚糖的鱼糜凝胶具有较完整且致密、规则的凝胶网络结构，反应4 h后鱼糜凝胶变得粗糙、不均匀，甚至出现片状结构，长时间的加热不利于鱼糜形成较好的网络结构，其凝胶网络的破坏与肌球蛋白重链被蛋白酶水解有关[18]。添加了葡聚糖的鱼糜凝胶的微观结构没有较完整致密的凝胶网络结构。葡聚糖添加比例为2∶1的鱼糜凝胶有较稀疏的网络结构，且随着反应时间的延长，凝胶的孔径稍有变大，有细小的团聚体出现在稀疏的网络节点上；葡聚糖添加比例为1∶1和1∶2的鱼糜凝胶从反应开始就形成了细小且均匀的小球体并聚集成团，随着反应时间的延长，聚集团没有显著差异，且没有形成有规则的凝胶网络结构。

鱼糜形成凝胶的过程分为两个阶段，第1阶段是加热鱼糜蛋白质使其发生一定程度的变性和伸展，肌球蛋白尾部解螺旋，暴露的一些氢键和疏水基团通过非共价键结合，第2阶段是各暴露的巯基、游离氨基等功能基团之间形成稳定的共价键，于是产生了凝胶网络结构[8]。未添加葡聚糖的鱼糜凝胶在加热过程中经历这两个阶段，然而随着加热时间的延长，由于鱼糜凝胶中内源酶的作用使鱼糜凝胶劣化[24]，凝胶网络结构被破坏，出现局部呈片状结构，局部有网络结构。而添加了葡聚糖后，在加热的情况下，鱼糜蛋白和葡聚糖发生糖基化反应，将鱼糜蛋白上的游离氨基基团消耗，糖基化反应会产生甲酸、乙酸等中间产物降低环境的pH值，影响凝胶网络结构的形成。另一方面，葡聚糖上含有较多的游离羟基基团，易于与鱼糜蛋白质伸展暴露的基团形成氢键等，从而占用了胶凝作用本身应该形成氢键的位点，使得凝胶网络无法正常形成，从而降低了蛋白质的凝胶性质。

图5 反应时间和葡聚糖比例对鱼糜凝胶微观结构的影响Fig.5 Effects of reaction time and sugar ratio on the microstructure of surimi gel

3 结论

未添加葡聚糖制备的鱼糜凝胶（CK组）的pH、凝胶强度及微观网络致密度随着加热时间的延长而显著降低。与CK组相比，葡聚糖添加量越多，制备的鱼糜凝胶的凝胶特性越弱，但随着加热时间的延长，其凝胶特性没有显著性差异。因此，葡聚糖在鱼糜加热过程中与鱼糜蛋白发生了糖基化反应，且葡聚糖的添加降低了鱼糜的凝胶特性，但增强了鱼糜凝胶在加热过程中的稳定性。