莲子壳多酚的抗氧化活性和稳定性

2020-01-02张海晖李亚群段玉清陆玉洪孙冀平

中国食品学报 2019年12期

颜征张海晖李亚群段玉清* 陆玉洪孙冀平

（1 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江 212013

2 江苏怡味莲朗伯食品有限公司江苏宝应 225800）

莲子壳是睡莲科植物莲种子的壳，莲子壳作为莲子加工的副产物，通常被焚烧而未被充分利用，造成资源浪费。有文献报道新鲜莲子壳富含单宁、黄酮[1]、花青素[2]等多酚类物质，具有很高的利用价值。植物多酚又称植物单宁或鞣质，是一种植物体内多元酚类次生代谢物，广泛存在于植物的皮、根、叶和果实中[3]。植物多酚具有良好的抗氧化、抑菌、抗肿瘤等生物活性[4-8]。亚临界水是介于其沸点和临界温度（100～374℃）之间，维持在适当压力下的水[9]。常温常压下，水的极性较强，在亚临界条件下，随着温度的升高，水的氢键被打开或减弱，对中性或非极性有机物的溶解能力也会增加[10]，从而可以连续提取天然产物中的水溶性成分和脂溶性成分。亚临界水对多糖类、皂甙类、黄酮类大分子化合物的提取效果较优[11]。亚临界水萃取技术以价廉、无污染的水作为溶剂，被视为绿色环保、前景广阔的一项变革性技术[12]。本文采用亚临界水萃取技术和大孔树脂联用制备莲子壳多酚，并对多酚的抗氧化活性和储藏稳定性进行研究，以期提高莲子壳多酚的利用率，为后期产品开发提供理论基础[13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜莲子壳购于江苏省镇江市农贸市场。AB-8型大孔树脂购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。没食子酸、福林-酚试剂、亚硫酸氢钠、无水碳酸钠、三氯化铁、DPPH、ABTS、VC、乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SGH型亚临界水反应釜，镇江丹徒环球机电配件厂生产；UV-1601紫外-可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；ALPHAI-4/2-4冷冻干燥机，德国CHRIST公司；DL-5C离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-9015A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；JA2003分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；GFB型中药粉碎机，上海一恒科学仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 莲子壳多酚的制备将莲子壳烘干后粉碎，过100目筛。称取一定量的莲子壳粉末，按水料比 30∶1（mL/g）加入萃取釜中，并加入溶剂量1‰的NaHSO3作为辅助萃取剂，控制萃取温度160℃下萃取15 min。将萃取液经4 000 r/min离心8 min，并抽滤得到莲子壳多酚粗提液，粗提液过AB-8大孔吸附树脂柱分离/富集，用体积分数70%乙醇水溶液洗脱（流速2 mL/min），收集洗脱液，45℃下减压浓缩，将浓缩液真空冷冻干燥，即为莲子壳多酚粉末。

1.3.2 多酚含量的测定采用福林-酚法[14]稍作修改。取一定体积的Folin试剂稀释10倍，取该稀释液4 mL加入到1 mL样液中，然后加入7.5%的碳酸钠溶液5 mL，25℃静置2 h后，于765 nm测定吸光度。以没食子酸为标准物质，配成浓度梯度为 12.5，25，50，100，150，200μg/mL 的样液，建立标准曲线，求得没食子酸浓度与吸光度的回归方程。

1.3.3 莲子壳多酚的抗氧化性测定

1.3.3.1 还原能力测定还原能力测定，参照李金凤等[15]的方法。取25～200 μg/mL的莲子壳多酚样品1 mL分别加入pH值为6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL和10 mg/mL的铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀，50℃保温20 min后取出，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀后于700 nm处测定吸光度。以不加多酚样品为空白对照。与VC比较。吸光度越大，表明样品还原能力越强。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力测定参照Choe等[16]的方法。将莲子壳多酚样品配成25～200 μg/mL的溶液（无水乙醇配制），取2 mL于试管中，加入 2 mL DPPH·无水乙醇溶液（200 μmol/L）。混匀后在室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度，记为Ax。空白组：2 mL无水乙醇和2 mL多酚样品溶液（不同浓度）；对照组：2 mL的DPPH·溶液和2 mL无水乙醇，在517 nm波长下测定吸光度，记为Ao。与VC比较。DPPH·清除率的计算见公式（1）：

1.3.3.3 ABTS自由基清除能力测定参照Akkarih等[17]的方法，稍作改进。

（1） ABTS+·溶液的配制：7 mmol/L ABTS 溶液与 4.9 mmol/L过硫酸钾溶液以 1∶1（V/V）充分混匀，室温避光放置 12～16 h（避光），形成 ABTS+·储备液，备用。使用时稀释，使得稀释液734 nm处的吸光值0.7±0.02，现用现配。

（2）试验方法：用无水乙醇配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液，各取200 μL于试管中，加入4 mL的ABTS+·溶液，充分振摇30 s，室温下反应6 min（避光），于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Ai。对照管：200 μL无水乙醇和4 mL ABTS+·溶液，于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Ao；标准管：200 μL样液和4 mL无水乙醇，于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Aj。与VC比较。ABTS+·清除率的计算见公式（2）：

1.3.3.4 O·2-清除能力测定参照Zhang等[18]的方法，稍作改进。配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液。取4.5 mL Tris-Hcl缓冲液于10 mL具塞比色管中，在20℃水浴预热20 min后，分别加入不同浓度的多酚样品溶液1 mL和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，摇匀后用蒸馏水稀释至刻度。置于25℃水浴反应5 min，取出后立即加入8 mol/L HCl溶液1 mL，终止反应。于299 nm处的吸光度Ai。空白以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度Ao；考虑到样品液本底的影响，同时测定不加邻苯三酚溶液的相同浓度的样品溶液的吸光度Aj，并与VC做比较。O·2-清除率的计算见公式（3）：

1.3.3.5 NO2-清除能力测定参照龚明贵等[19]的方法。配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液。准确吸取5 mg/L的NaNO2溶液2 mL置于25 mL比色管中，分别加入2 mL不同浓度的多酚样品溶液，25℃下水浴30 min，取出后立即加入1 mL对氨基苯磺酸溶液（4 g/L），摇匀后于25℃下水浴5 min，再分别加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L），用蒸馏水定容至刻度，摇匀，于25℃水浴15 min后于538 nm处测定吸光度。以蒸馏水为参比，并于VC比较。NO2-清除率的计算见公式（4）：

式中：Ao——空白对照液的吸光度；Ax——加入样品后的吸光度；Axo——样品本底的吸光度。

1.3.4 莲子壳多酚的稳定性研究

1.3.4.1 pH值对莲子壳多酚稳定性的影响用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠配成pH分别为 2，4，6，8，10，12 的溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。

1.3.4.2 光照对莲子壳多酚稳定性的影响配制一定浓度的多酚水溶液，摇匀，将其分别放置于避光和自然光的条件下，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm波长下测其吸光度。

1.3.4.3 温度对莲子壳多酚稳定性的影响配制一定浓度的多酚水溶液，摇匀，将其分别放置于37℃、室温（25℃）、4℃的条件下，每隔3 d取样1 mL，并稀释3倍，在280 nm波长下测其吸光度。

1.3.4.4 食盐对莲子壳多酚稳定性的影响配制浓度分别为0.02，0.04，0.06 g/mL的食盐溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。以蒸馏水加入适量多酚样品作为对照。

1.3.4.5 糖对莲子壳多酚稳定性的影响配制质量浓度为0.1 g/mL的葡萄糖溶液和0.1 g/mL的蔗糖溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。以蒸馏水加入适量多酚样品作为对照。

2 结果与分析

2.1 总多酚测定标准曲线和多酚含量

通过没食子酸浓度和吸光度建立标准曲线，得到回归方程为：y=0.005 x-0.0274，R2=0.992，表明没食子酸浓度与吸光度间具有良好的线性关系。通过该方程，求得莲子壳多酚粉末得率为4.03%，其粉末中多酚纯度为99.50%。

2.2 莲子壳多酚的抗氧化性

2.2.1 莲子壳多酚的还原能力抗氧化物在酸性条件下，将Fe3+还原成显蓝色的Fe2+，测定其吸光度，就能得到被测液体的还原力[20]。由图1可知，莲子壳多酚和VC均有较强的还原能力，且随样品浓度增大，吸光度不断增大，说明样品质量浓度越高，还原能力越强。

2.2.2 莲子壳多酚清除DPPH自由基的能力当溶液中存在抗氧化剂时，抗氧化剂能够给DPPH自由基提供氢原子和电子使其发生褪色，吸光值变小，其颜色变得越浅表明抗氧化剂的抗氧化能力越强[21]。从图2中可以得出，莲子壳多酚和VC均有较好的清除DPPH自由基效果。随着样品溶液浓度增大，DPPH自由基清除率增大，当样品溶液质量浓度为100 μg/mL时，莲子壳多酚对DPPH自由基的清除率达到95.45%。

图1 莲子壳多酚的还原能力Fig.1 Reducing power of polyphenols in lotus seeds hull

2.2.3 莲子壳多酚清除ABTS+·的能力抗氧化剂会将蓝绿色的ABTS+·还原成无色的ABTS，在734 nm波长处测定吸光度，吸光度变化越大，其清除能力越强[22]。莲子壳多酚和VC的清除ABTS+·能力如图3所示，随着样品浓度的增大，清除ABTS+·的能力增强。莲子壳多酚和VC均有较强的ABTS+·清除能力，当样品浓度低于100 μg/mL时，莲子壳多酚清除ABTS+·的能力强于VC；当样品质量浓度达到100 μg/mL以上时，莲子壳多酚和VC对ABTS+·的清除率均接近100%。

图2 莲子壳多酚清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH free radicals scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.4 莲子壳多酚清除O·2-的能力超氧阴离子自由基是反应性氧中间物的一种，其与羟基结合后的产物会对细胞DNA造成损坏，清除超氧阴离子自由基在抗氧化过程中起着重要作用[23]。由图4可知，莲子壳多酚和VC对超氧阴离子均有一定的清除效果，且随样品浓度增大，清除能力增强。

图3 莲子壳多酚清除ABTS+ ·的能力Fig.3 ABTS+ ·scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

图4 莲子壳多酚清除O·2- 的能力Fig.4 O·2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.5 莲子壳多酚清除NO2-的能力莲子壳多酚和VC对亚硝酸根离子的清除能力如图5所示，莲子壳多酚和VC对亚硝酸根离子均有较好的清除效果，随着样品浓度的增大，清除NO2-的能力增强。当样品溶液质量浓度为100 μg/mL时，莲子壳多酚对NO2-的清除率达到41.20%。

2.3 莲子壳多酚的稳定性

2.3.1 pH对莲子壳多酚稳定性的影响由图6可知，在pH 2～6之间时，莲子壳多酚较稳定，吸光值变化较小；在pH 8～12条件下，莲子壳多酚吸光值变化较大，表明在碱性条件下莲子壳多酚不稳定。这是因为多酚富含酚羟基，在酸性或中性条件下，多酚性质较为稳定；在碱性条件下，破坏了多酚的结构，生成其它物质[24]，在pH为12时，尤其明显。因此，应在酸性条件下保存莲子壳多酚。

图5 莲子壳多酚清除NO2- 的能力Fig.5 NO2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

图6 pH对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.6 Effect of pH the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.2 光照对莲子壳多酚稳定性的影响从图7可以看出，莲子壳多酚对光较敏感。在避光和自然光条件下，密封保存的0～3 d和9～15 d，莲子壳多酚的吸光度均略有增大，密封保存的3～9 d，莲子壳多酚的吸光度均略有减小，说明多酚类物质在贮存过程中可能发生部分聚合或降解，但两者具有相同趋势。

2.3.3 温度对莲子壳多酚稳定性的影响由图8可以看出，在4℃条件下保存，莲子壳多酚溶液吸光值变化很小；在室温和37℃条件下，莲子壳多酚溶液吸光值均有明显变化，说明莲子壳多酚结构发生变化，高温下莲子壳结构发生变化，故应在低温条件下保存莲子壳多酚。

图7 光照对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.7 Effect of light on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

图8 温度对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.8 Effect of temperature on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.4 食盐对莲子壳多酚稳定性的影响不同浓度食盐对莲子壳多酚稳定性的影响如图9所示，无食盐、0.02 g/mL食盐、0.04 g/mL食盐和0.06 g/mL食盐条件下，莲子壳多酚溶液吸光度变化相似，说明食盐既不会破坏莲子壳多酚，也不能保护莲子壳多酚。因此生产加工过程中，添加食盐不会影响莲子壳多酚的稳定性。