番茄红素纳米乳液体系的稳定性能研究

吴婉仪 李 璐 李达鸿 解新安 李 雁

（华南农业大学食品学院 广州 510642）

番茄红素作为一种天然类胡萝卜素被广泛应用于食品、药物和化妆品之中，具有增强人体免疫力、防治疾病和抗氧化等功效。然而，由于结构中存在多不饱和双键，番茄红素水溶性极差，且对氧气、光照、热等外在条件较为敏感，这些都严重限制了其在食品加工中的应用[1-2]。纳米乳液作为载运体系可显著提高此类生物活性物质的溶解性和生物利用率[3-4]。

纳米乳液作为功能性营养成分的载运体系，体系的稳定性研究是一个重要的研究领域[5-6]。目前对影响纳米乳液稳定性的研究多针对小分子乳化剂[7-10]，而对于利用较为安全的生物兼容大分子乳化剂制备纳米乳液的稳定机理研究并不多[11-13]，较少从纳米乳液的不稳定现象分析和应用稳定性等方面探讨稳定机理。本研究采用食品级辛烯基琥珀酸酯化淀粉 （OSA变性淀粉）为大分子乳化剂，以MCT为油相，采用高压均质法，根据课题组前期研究确定的最佳制备工艺制备负载番茄红素纳米乳液，利用基于光散射原理的Turbiscan AGS稳定性分析仪分析乳液的不稳定现象，考察不同的储藏环境因素对纳米乳液稳定性的影响，并对其在食品体系中的应用稳定性进行研究。本试验研究结果将为纳米乳液体系的稳定机理研究和实际应用提供较好的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辛烯基琥珀酸酯化淀粉（OSA 变性淀粉），广东佛山德峰淀粉糖业有限公司；中链甘油三酯（MCT），广州耶尚贸易公司；番茄红素标准品（≥90%），上海源叶生物科技有限责任公司；二甲亚砜（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；二氯甲烷（分析纯），广东光华科技股份有限公司；正己烷（分析纯），广东光华科技股份有限公司；氯化镁（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；蔗糖 （分析纯），天津市大茂化学试剂厂；氯化钠（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Scientz-150高压均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司；FJ200高速分散均质搅拌器，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；UV-2500紫外可见分光光度计，德国斯派克分析仪器公司；Turbiscan AGS稳定性分析测试仪，法国Formulaction公司；纳米粒度及Zeta电位分析仪，Zetasizer Nano ZS90，英国Malvern公司。

1.3 番茄红素纳米乳液的构建

首先在70℃下将质量分数为30%的辛烯基琥珀酸酯化淀粉溶解于去离子水，并在常温下搅拌过夜，使其充分水化，制得水相。然后将番茄红素溶解于MCT油中，配置质量分数为0.1%番茄红素油溶液，并采用磁力搅拌器搅拌，直至番茄红素完全溶解于油相中为止。接着将水相与油相按9∶1的比例混合搅拌均匀后，在高速分散机上以18 000 r/min分散4 min制得粗乳液，再将制得的粗乳液在110 MPa下均质3次得到番茄红素纳米乳液。在制备过程中，所有的容器均使用锡箔纸包裹，以减少番茄红素的损失。

1.4 番茄红素纳米乳液粒径及电位测定

乳液采用Zetasizer Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪测定其粒径大小和Zeta电位，测定温度固定在25℃，所有的乳液均使用去离子水稀释100倍后再进行检测。

1.5 乳液中番茄红素量负载率和保留率的计算

1.5.1 乳液中番茄红素含量的测定 番茄红素溶液在低浓度范围内满足朗伯-比尔定律，因此选用分光光度法测定纳米乳液中番茄红素的量[14]。

标准曲线绘制：准确称取2.1 mg番茄红素标品，以少量二氯甲烷溶解，加入正己烷定容至10 mL为1号母液。于1号母液中分别吸取10，50，100，500，1 000，2 000 μL 置于 6 个 10 mL 的容量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀，即配成番茄红素质量浓度为 0.2，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/mL 的标准溶液。以正己烷为参比，依次在472 nm下测其吸光度。

乳液中番茄红素含量测定：取200 μL新制的番茄红素乳液样品与800 μL的DMSO均匀混合，然后依次加入2 mL的正己烷∶二氯甲烷的混合有机相（3∶1，V∶V）进行萃取，重复萃取 3 次后合并萃取液，在3 000 r/min下离心10 min，取上层清液置于分光光度计下测定番茄红素的吸光值。以正己烷作为空白对照，测定波长为472 nm，结果通过标准曲线算出。

1.5.2 番茄红素的负载率 计算方程如 （1）式所示：

式中：C1——新鲜乳液中番茄红素的质量浓度，μg/mL；C0——均质前加入番茄红素的质量浓度，μg/mL。

1.5.3 番茄红素的保留率 计算方程如（2）式所示：

式中：C2——在储藏时间t时乳液中番茄红素的质量浓度，μg/mL；C3——储藏前乳液中番茄红素的质量浓度，μg/mL。

1.6 稳定性分析仪分析乳液的物理稳定性

纳米乳液的稳定性分析通过Turbiscan AGS稳定性分析测试仪进行测得。将新制纳米乳液样品放入20 mL的测量池内进行测量，每1 h扫描一次，比较分析样品乳液组与空白乳液组在24 h内的稳定性。得到的扫描曲线为透射光和背散射光随样品高度的变化关系，反映了乳状液内部的微观变化[15]。透射光和背散射光强度以%表示，通常，透射光用于分析透明样品，而背散射光可用于分析乳液这类低透明度的样品。

乳液的稳定性还可以通过稳定性动力学指数TSI（Turbiscan Stability Index）来进行表征，其定义如式（3）：

式中：IBi（h）、IBi-1（h）分别为测量高度为 h 时，第i次和第i-1次扫描背散射光强，i=1时，TSI定义为0；H为1至i次扫描时样品高度的数值。TSI是样品整体高度上在给定时间内光强变化的绝对值加和，其数值越大，说明样品体系浓度或颗粒粒径变化越大，体系越不稳定[16]。

1.7 番茄红素纳米乳液储藏稳定性

取一定量的新制番茄红素纳米乳液装瓶，分别于（1）室温（25℃），光照；（2）室温，避光；（3）4℃，避光；（4）4℃，避光，充氮气的条件下静置储藏28d，每隔一周进行取样，测定乳液的粒径及番茄红素保留率的变化。

1.8 番茄红素纳米乳液在不同应用体系条件下的稳定性

1.8.1 pH 稳定性 配制 pH 为 2，3，4，5，6，7，8和9的磷酸盐缓冲液，分别将200 μL新制的番茄红素纳米乳液稀释100倍后，置于室温平衡4 h，测定其粒径及电位。

1.8.2 离子稳定性 配制不同浓度的盐离子溶液，其中NaCl浓度为0到1 mol/L，MgCl2浓度在0到0.016 mol/L，将200 μL新制的番茄红素纳米乳液用对应的盐溶液进行稀释100倍后，置于室温平衡4 h，测定其粒径及电位值。

1.8.3 蔗糖稳定性 配制质量分数为0～16%的蔗糖溶液，将200 μL新制的番茄红素纳米乳液稀释100倍后，置于室温平衡4 h，测定其粒径，并在600 nm处测其吸光值（浊度测量）。

1.9 数据统计分析

所有试验都至少重复3次并采用平均值，采用Microsoft excel2016软件进行方差分析，试验数值间以 Duncan法（P＜0.05）进行差异显著性分析。Turbiscan AGS稳定性分析仪采集数据使用Turbi Soft 2.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 番茄红素纳米乳液的不稳定现象分析

纳米乳液作为一种热力学不稳定的体系，在储藏的过程中会发生粒子的碰撞，颗粒之间相互聚集的现象影响着纳米乳液的储藏稳定性[17]。以空白乳液为对照，图1为纳米乳液体系的背散射光强度随样品高度的变化曲线。横坐标表示乳液样品高度（底部高度为0），纵坐标表示背散射光强度（BS），图线的不同颜色反映了不同背散射光强度随时间的变化而变化的情况。同时利用Turbiscan计算不同乳液的TSI指数，以比较空白乳液和番茄红素纳米乳液的稳定性，结果如图2所示。

从图1可以看出，在观察时间内，纳米乳液发生了一定的由乳液内部的水相浓度减小，分散相油相逐渐上浮脱出而引起的失稳，还伴随着乳液整体的BS（%）随时间的推移而增加（初始时为底部的蓝色线条），表明乳液的粒径在增大，这是奥斯特瓦尔德现象[18-19]，即在拉普拉斯压力差的作用下，分散相从小的液滴扩散转移至较大的液滴的现象。可见纳米乳液作为一种热力学不稳定体系，沉淀和奥氏熟化是导致其失稳的主要原因。由图2可以看出，随着测试时间的延伸，纳米乳液体系的TSI值缓慢增加，表明乳液在逐渐趋于不稳定，但同时间点下番茄红素纳米乳液TSI值均高于作为对照的空白乳液，说明番茄红素载入后纳米乳液体系的稳定性有一定的影响，使得番茄红素纳米乳液较空白乳液更易不稳定。

图1 乳液△BS随扫描时间和扫描高度的变化图Fig.1 The change of△BS during scan procedure

图2 乳液的TSI值的变化图Fig.2 The change of the TSI during scan procedure

2.2 储藏环境对番茄红素纳米乳液性质的影响

将制备的番茄红素纳米乳液分成4组，分别置于（1）室温（25℃），光照；（2）室温，避光；（3）4℃，避光；（4）4℃，避光，充氮气的条件下静置储藏28 d，并在一定的时间对乳液粒径和番茄红素保留率进行测定，分析温度、光照和氧气等因素对纳米乳液的储藏稳定性的影响。

图3 不同储藏条件下番茄红素纳米乳液粒径的变化Fig.3 Evolution of mean diameters of lycopene nanoemulsions over time upon different store conditions

2.2.1 储藏过程中纳米乳液的粒径变化 从图3可以看出，在所有的储存条件下，乳液的粒径均会随着储藏时间的延长而增加。其中乳液在室温下储藏28 d后的粒径增长幅度最大，为20%左右，当储藏温度下降至4℃时，乳液表现出更好的储藏稳定性即更小的粒径增加幅（12%）。相较于温度对样品粒径的作用效果，光照和氧气的作用则要小得多。从以上试验结果可以推测，在储藏温度、光照和氧气3种储藏条件中，储藏温度是影响纳米乳液稳定性最为重要的参数，其次是光照、氧气。根据Tse K Y等[20]的研究，乳液在较高温度下的不稳定，可能是由于系统黏度的降低和分子较大的流动性造成的。但是总体而言，在储藏28 d内，所有乳液均无明显的相分离或乳化分层现象发生。

2.2.2 纳米乳液中番茄红素在储藏过程中保留率的变化 由于番茄红素对外界环境极其敏感，因此，将乳液在不同条件下储藏28 d，分别考察温度、光照和氧气对乳液中番茄红素保留率的影响。对于每个不同的储藏条件，溶解在MCT油相中的番茄红素样品被作为对照组，与乳液中番茄红素的稳定性进行对比。

结果如图4所示，所有样品中的番茄红素保留率均随着储藏时间的增加而减小。但在25℃、光照作用下静置28d后，乳液中番茄红素的保留率依然高于40%，相较对照样品中的番茄红素在2周内就已完全消耗殆尽有着明显的改善；而25℃下避光处理的乳液中番茄红素保留率并没有显著降低，推测光照对番茄红素的降解作用较小。在所有样品中，在4℃、避光、充氮气的条件下储藏28 d后的乳液番茄红素保留率最大，为67%，比不充氮气的样品保留率高出13%左右，而在同样做避光处理的乳液中，4℃下储藏样品的保留率比25℃高9%。根据以上试验结果可以推测，氧气是影响番茄红素纳米乳液储藏稳定性最重要的因素，其次是温度、光照。

图4 不同储藏条件下番茄红素保留率的变化Fig.4 Retention of lycopene in nanoemulsions over time with different store conditions

2.3 番茄红素纳米乳液应用稳定性研究

负载番茄红素的纳米乳液作为一种功能组分运输体系，如果可以直接加入食品体系将会极大提高其应用方便性[21]。当纳米乳液应用于食品领域时，需要经受不同的加工条件、不同浓度的盐离子以及蔗糖溶液，为了获得各项稳定性都良好的乳液体系，对所制备番茄红素纳米乳液进行应用稳定性试验，包括pH稳定性试验、离子稳定性试验以及蔗糖稳定性试验，来评价所构建纳米体系的应用稳定性。

2.3.1 pH稳定性 将所构建番茄红素纳米乳液添加到不同pH的磷酸盐缓冲液中，测定其粒径及电位值的变化情况，结果如表1所示。

表1 不同pH下纳米乳液的粒径和电位Table1 The mean particle size and zeta potential of nanoemulsions prepared with different pH

由表1可知，番茄红素纳米乳液的Zeta电位值的绝对值随着pH的上升而递增，粒径则呈现先减小后增大的变化规律。样品的酸碱稳定性较强，过酸和过碱都会造成纳米乳液的稳定性下降。综合来看，番茄红素纳米乳液的耐酸性比较强。这是由于OSA变性淀粉为阴离子型生物大分子乳化剂，体系的pH值影响其解离，改变其在界面膜表面的吸附性能，进而影响乳液的稳定性[22]。在酸性条件下，H+很容易与OSA分子结构中的RCOO－相互吸附，导致油水界面层表面电负性减弱，电位值减小，OSA分子间的静电排斥效应减弱，单个分子占有空间缩小，更多游离的OSA分子被吸附到界面处。在碱性条件下，随着溶液pH值的增加，分子结构中的R-COO－会不断发生电离，乳液表面的电位值增大，有效功能基团间较强的排斥效应使OSA淀粉分子充分伸展，单个分子在油水界面所占有的空间范围变大，此时界面膜的空间位阻效应阻拦体系中自由态分子的进一步吸附[23]。可见，番茄红素纳米乳液在pH为3～6的范围内较为稳定，此时静电排斥作用减弱，但强大的空间位阻作用保证了纳米乳液粒径的稳定性；当pH＞7时，界面膜的空间位阻效应减弱，尽管静电排斥作用增强，却不足以维持结构的稳定，乳液的粒径增大。

2.3.2 离子稳定性 电解质是维持人体各项生命活动的重要物质，具有调节肌肉收缩，保持酸碱平衡等重要作用。在食品和饮料产品生产过程中，通常需要添加离子来提供人体电解质平衡，最常见的有Na+和Mg2+，将番茄红素纳米乳液在0～1.0 mol/L的NaCl溶液和0～0.016 mol/L的MgCl2溶液中的粒径和电位值随离子浓度的变化情况，结果如图5和图6所示。

从图中可以看出，Na+和Mg2+的添加导致了乳液的电位值的绝对值显著下降，然而不同浓度的NaCl和MgCl2并不会显著影响纳米乳液的粒径，二者的乳液粒径增长幅度均不超过10%，结果与冯建国[24]在探究高分子化合物对氟虫脲水悬浮剂的稳定性影响中得出的规律一致：电解质的添加会降低电位值。这是因为以OSA变性淀粉稳定的纳米乳液是通过油水界面层的静电排斥作用和空间位阻作用来维持乳液的稳定，电解质离子添加后附着于油水界面层，压缩界面层使其变薄，降低电位值。同时，带负电荷的R-COO－所产生的静电排斥作用因被Na+和Mg2+屏蔽而减弱，软化了分子结构，单个分子在油水界面所占有的空间范围缩小，更多OSA分子吸附在乳液表面，体系的空间位阻效应增强，可以有效减缓乳液的凝聚。因此将番茄红素纳米乳液直接添加到食品体系中时，食品体系中的盐离子并不会影响其使用性能。

图5 不同NaCl浓度下番茄红素纳米乳液的粒径和电位值Fig.5 Influence of NaCl concentration on the mean particle size and zeta potential of lycopene nanoemulsions

图6 不同MgCl2浓度下番茄红素纳米乳液的粒径和电位值Fig.6 Influence of MgCl2concentration on the mean particle size and zeta potential of lycopene nanoemulsions

2.3.3 蔗糖稳定性 目前有很多机制说明蔗糖对乳化体系的稳定性具有促进作用[25]：首先蔗糖增大了连续相的黏度，有效减少体系中乳液间发生相互撞击的频率[26]；其次蔗糖会改变了纳米乳液溶液的物理化学性质，改变排斥效应强度，进而减缓乳液间碰撞的频率；最后，蔗糖溶液能降低连续相中氧含量，有助于减缓番茄红素的氧化降解。配置浓度质量分数2%到18%的蔗糖溶液，研究其对番茄红素纳米乳液粒径和吸光度的影响，结果如图7所示。

图7 蔗糖浓度质量分数对番茄红素纳米乳液粒径和吸光值的影响Fig.7 Influence of sucrose concentration mass fraction on the mean particle size and absorbance of lycopene nanoemulsions

可以看出，当蔗糖质量分数从2%上升至18%时，体系中纳米乳液的粒径由151 nm增加到228 nm，增长幅度达到50%，说明蔗糖质量分数对乳液的粒径影响显著，这是因为蔗糖分子会同OSA变性淀粉分子的亲水基团相结合，致使粒径的增大。而伴随着蔗糖浓度的增大，吸光值变小，样品的外观变得更加透明，这有利于其在食品饮料体系中应用[27]。综上所述，食品饮料中蔗糖的浓度不仅不会影响番茄红素纳米乳液的稳定性，还有利于提高其应用效果。

3 结论

本研究以食品级生物大分子辛烯基琥珀酸酯化淀粉为乳化剂，以MCT为油相，在高压均质的条件下制备负载番茄红素纳米乳液。采用Turbiscan AGS分析仪对体系稳定性的检测及分析发现纳米乳液作为一种热力学不稳定体系，沉淀和奥氏熟化是导致其失稳的主要原因。进一步比较乳液在不同外界条件下的储藏稳定性发现：温度对乳液粒径增长的影响最为明显，其次是光照和氧气。而对番茄红素保留率影响最显著的条件是氧气，其次是温度和光照。番茄红素纳米在4℃避光充氮气的条件下储藏1个月后，乳液粒径从138 nm增加到157 nm，保留率为41%，远高于对照组，体现了良好的稳定性。对番茄红素纳米乳液的应用稳定性研究发现，番茄红素纳米乳液的耐酸性较强，盐离子和蔗糖分子并不会对纳米乳液结构造成太大的影响。本研究对番茄红素纳米乳液稳定性的研究结果表明所构建的纳米乳液具有较好的稳定性及在食品体系的应用潜力，并为进一步的稳定机理研究提供数据支持。