6，7-二甲氧基香豆素对K562 细胞红系分化的影响*

杨爱华，施 卉，许 波，卞姜培，郑 丽**

1 南通市妇幼保健院 药事科，南通 226018；2 南通大学药学院，南通 226001

母儿血型不合是指孕妇与胎儿间血型不合产生的同族血型免疫病[1]，该病可导致孕期早产、流产、死胎等[2]，新生儿出生后也可导致黄疸及新生儿溶血性贫血[3]。本课题组前期研究表明茵陈蒿汤（茵陈、栀子、大黄）用于治疗该病，可降低母体血清抗体效价、改善妊娠结局[4]、新生儿溶血性贫血的临床症状；但其药效物质基础并不明确。

6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin，6，7-DOC），又称滨蒿内酯（scoparone），从茵陈中提取。文献[5，6]表明，6，7-DOC 有抗炎、抗肿瘤、保肝和心血管活性等作用，且是治疗母儿ABO 血型不合、预防新生儿溶血性贫血的药效物质基础[7]，然而其在红血球分化中的作用尚未被证实。在本研究中，使用人慢性髓原白血病细胞（简称K562 细胞）来评价6，7-DOC 对K562 细胞红系分化的影响。

1 材 料

1.1 细胞株

K562 细胞购自上海盖宁生物科技公司。

1.2 药品、试剂与仪器

药品与试剂：6，7-DOC（纯度>99%，世洲生物，南京）；氯化高铁血红素（Hemin，Sigma 公司）；10%胎牛血清（FBS，Hyclone 公司）；RPMI-1640 培养基（索莱宝科技有限公司），Western 化学发光试剂盒（ECL，Perkin Elmer 公司）；蛋白分子量Marker（Fermentas 公司）；GAPDH 兔抗人多克隆抗体（Abcom公司）；α-globin、β-globin、γ-globin 一抗、兔二抗（CST 公司）；二甲亚砜（DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、细胞活力检测试剂盒CCK-8（碧云天试剂公司）。

仪器：Forma Series ⅡCO2培养箱（Thermo 公司）；低温离心机（Beckman Coulter 公司）；流式细胞仪（Accuri Cytometers 公司）；显微镜（Olympus 公司）；Power Wave.X34 型多道扫描酶标仪（Bio-Tek公司）；BIO-RAD 电泳及转膜系统、超高灵敏度化学发光成像系统（Bio-Rad L 公司）。

1.3 试剂的配制

1.74mg 6，7-DOC 溶 解于10 mL 甲醇得到1 mmol·L-1溶液，分别用纯水稀释1000、200、100 倍得到1、5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 液。

2 方 法

2.1 细胞培养

将K562 细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640 （含双抗，pH=7.2） 培养基内，于37 ℃、5%CO2饱和湿度为95%的恒温箱中孵育，每2～3 d 传代一次。细胞处于对数生长期时用于实验。

2.2 药物分组干预与诱导分化实验

实验分为5 组：对照组、阳性药（Hemin）组、6,7-DOC 低、中、高剂量组。对照组加入等量的RPMI1640 培养液，阳性对照组加入等量的终浓度为24 μmol·L-1的Hemin 工作液，6，7-DOC 低、中、高剂量组浓度分别为1、5、10 μmol·L-1。分别在干预0、24、48、72 h 收集细胞进行联苯苄胺染色处理。

2.3 联苯苄胺染色测定

采用不同处理方法收集K562 细胞，用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗2 次。将含30%H2O2的联苯苄胺溶液0.2 mL（冰醋酸2 mg·mL-1）加入悬浮液中，室温孵育10 min。阳性细胞染成蓝色，在显微镜下计数。

2.4 免疫印迹分析

采用细胞裂解液加1%蛋白酶抑制剂（PMSF）提取总蛋白。采用BCA（bicinchoninic acid）法测定蛋白浓度。40 μg 蛋白质10%分离胶进行凝胶电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后用5%脱脂牛奶和0.1%吐温-20 在3 倍缓冲盐水中封膜。随后用一抗在4 ℃孵育过夜，用TBST 缓冲液冲洗3次，用二抗孵育2 h。采用增强型化学发光（ECL）系统试剂盒检测条带。利用Image J 软件分析灰度值。

2.5 6，7-DOC 对K562 细胞增殖的影响

CCK-8 检测细胞增殖：收集细胞，110×g 离心5～10 min，弃去上清液，加入新培养基。重复110×g离心5～10min，弃去上清液，加入含有CCK-8 的培养基，轻轻吹打均匀，分别加入96 孔板中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养3h，用酶标仪检测450nm 处的吸光度值（A）。存活率（VR，Viability Rate）=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组），分别计算6，7-DOC 浓度为1、5、10 μmol·L-1及Hemin 12、24、48、72 h 的细胞存活率。所有实验均为一式3 份。

2.6 6，7-DOC 对K562 细胞周期的影响

采用不同浓度的6，7-二甲氧基香豆素处理K562 细胞，PBS 洗涤3 次。细胞凋亡分析，细胞染色按照PI 试剂盒说明书操作，细胞周期检测采用流式细胞仪。

2.7 统计学方法

采用SPSS16.0 软件统计，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间统计用单因素方差分析。P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 6，7-DOC 促进K562 细胞向红系定向分化

K562 细胞含有少量血红蛋白，它的增多是K562 细胞向红系分化的标志，血红蛋白含量与联苯苄胺染色阳性率呈正相关，可反映K562 细胞红系定向分化的程度。经Hemin 诱导后的K562 细胞可向红系定向分化，在第4 天达峰后衰减[8]。

本研究采用24 μmol·L-1Hemin 诱导K652 细胞向红系分化作为阳性组，1、5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 诱导K652 细胞，联苯苄胺染色结果见图1，其联苯胺染色阳性率结果见表2。

表2 K562 细胞红系分化的联苯苄胺染色阳性率（%，n=3）

由图2 可知，1μmol·L-16，7-DOC 组联苯苄胺染色阳性率与对照组无明显差异；5、10μmol·L-16，7-DOC组联苯苄胺染色阳性率显著高于对照组（**P<0.01），且呈剂量、时间依赖性。故在红系标志蛋白检测试验中，选用10μmol·L-16，7-DOC 作为主要研究对象。

红系分化典型标志蛋白α-珠蛋白（α-globin）、β-珠蛋白（β-globin）、γ-珠蛋白（γ-globin）的表达量，是衡量细胞红系分化能力的指标。Western blot实验显示6，7-DOC 组（10 μmol·L-1）中α、β、γ 珠蛋白表达量均显著高于对照组，结果见图3。

3.2 6，7-DOC 抑制K562 细胞增殖，并使细胞周期阻滞于G0/G1 期

用CCK-8 检测不同剂量6，7-DOC 对K562 细胞增殖的影响，见图4。1 μmol·L-16，7-DOC 组与对照组无明显差异；从第12 h 开始，5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 组细胞增殖减慢，以72 h 为终点，两组细胞增殖率均显著低于对照组。这表明6，7-DOC 剂量越大、作用时间越长，抑制K562 细胞增殖作用就越强，呈剂量、时间依赖性。

用流式细胞仪检测不同剂量6，7-DOC 对K562细胞周期的影响，见图5。与对照组比较，1 μmol·L-16，7-DOC 组无显著差异；5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 组G0/G1 期的细胞比例增高，而S 期细胞比例显著下降。而随着剂量增长，6，7-DOC 能够阻止细胞从G0/G1 期进入S 期，DNA 合成受到抑制，提示6，7-DOC 可诱导K562 细胞周期阻滞于G0/G1 期。

4 讨论

细胞周期分为间期和分裂期。间期又分为G0/G1 期（DNA 合成前期）、S 期（DNA 合成期）和G2 期（DNA 合成后期）；分裂期为M 期。细胞分化主要发生在间期。本研究结果显示，6，7-DOC 可以诱导处于多能髓样祖细胞状态的K562 细胞大量阻滞于G0/G1 期，促使细胞退出细胞周期，促进分化，因此在本实验中，6，7-DOC 作为重要的诱导分化剂，抑制细胞增殖，发挥其促进K562 细胞红系分化的作用。

处于多能髓样祖细胞状态的K562 细胞含有少量血红蛋白，而血红蛋白的增多是K562 细胞向红系分化的标志。不同时期，血红蛋白组成为胚胎血红蛋白（embryonic hemoglobin，HbE）、胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，HbF） 和成人血红蛋白（adult hemoglobin，HbA）[9]。血红蛋白是红细胞主要的物质，占到其总量的97%，是评估贫血的重要指标。Western blot 实验结果显示，6，7-DOC 预处理后可以显著增加血红蛋白标志物α-globin、β-globin、γglobin 蛋白的表达，新生儿溶血性贫血引起的胎儿宫内贫血，最主要的表现为低血红蛋白，因此6，7-DOC 通过增加血红蛋白合成量，可有效缓解该病的贫血症状，是治疗HDFN 的重要药效物质基础。因此，本研究结果提示，6，7-DOC 可能成为治疗母儿ABO血型不合所致HDFN 的一个新方向，扩大了对6，7-DOC 药理活性的认识，值得深入探究。