甘麦大枣汤对焦虑型肠易激综合征大鼠行为学和肠组织中5-HT、SP、CGRP、TNF-α 的影响研究*

2020-01-01朱静，孙峰，朱华**，甘瑜，陈旭，3

药学与临床研究 2020年6期

朱静，孙峰，朱华**，甘瑜，陈旭，3

1 江苏省苏北人民医院，扬州 225001；2 扬州大学医学院，扬州 225001；3 大连医科大学药学院，大连 116044

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是临床上常见的胃肠道功能性疾病，属于世界级难治性疾病之一，患者以反复发作的腹痛、腹泻为主要临床表现[1]。IBS 病理机制复杂，其常与多种肠道神经信号传导因子神经肽以及炎症因子相关，如5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、P 物质（substance-P，SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。临床研究发现，焦虑抑郁均是其常见的诱发因素和伴随症状，单纯胃肠动力调节药物对IBS 的疗效有限[3]，目前中药组方治疗IBS 的研究报道以调和肝脾、补脾柔肝的抗抑郁较为多见[4-7]，而对焦虑型IBS 及其对症治疗的药物研究较少。

甘麦大枣汤为经典的中药安神剂，具有和中缓急、养心安神的功效，主治心阴不足、肝气失和的脏躁证，即更年期综合征、神经衰弱、焦虑等。IBS 的焦虑症状也是甘麦大枣汤的适应症之一，临床已有类似应用和研究[8-10]。

本研究通过观察甘麦大枣汤对IBS 模型大鼠的肠组织病理形态和体内5-HT、SP、CGRP、TNF-α的影响，初步探讨甘麦大枣汤治疗焦虑型IBS 的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD 大鼠70 只，重量为（210±20）g，购自扬州大学实验动物中心，动物生产许可证号：SYXK（苏）：2017-0044。饲养条件：室温（25±2）℃，相对湿度为50%±10%，每日交替12 h 光照，自由饮水。

1.2 实验药物

甘麦大枣汤提取物为本实验室自制：炙甘草饮片（Glycyrrhizae uralensis Fisch.）、小麦饮片（Triticum aestivum L.）、大枣（Zizyphus jujube Mill.）均购自康美药业股份有限公司，按9∶15∶26 比例设方，共计1000 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮两次，合并两次药液，减压浓缩至1 g·mL-1备用。番泻叶（Cassia angustifolia Vah.）购自康美药业股份有限公司。取番泻叶500 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮两次，合并两次药液，减压浓缩至1 g药材·mL-1备用；盐酸洛哌丁胺（西安杨森制药有限公司），用生理盐水配制成0.05 mg·mL-1混悬液备用。

大鼠5-HT 酶联免疫试剂盒（货号：JM-01839R1）、大鼠SP 酶联免疫试剂盒（货号：JM-01851R1）、大鼠CGRP 酶联免疫试剂盒（货号：JM-02058R1）、大鼠TNF-α 酶联免疫试剂盒（货号：JM-01587R1），均购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.3 仪器

CPA225D 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Infinite M200 Pro 型酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)；电子分析天平（德国Sartorius 公司）；高速低温冷冻离心机（湘仪TGL-20M）。

2 方法

2.1 建立IBS 模型

从70 只SD 雄性大鼠随机取10 只作为空白对照。剩余60 只建立焦虑恐惧模型，给予大鼠条件性刺激程序：噪音刺激3 h·d-1；足底电击：间歇30 s 电击2 s，1 h·d-1；夹尾刺激：束缚3 h·d-1和番泻叶提取物1 g·mL-1灌胃2 mL，持续15 d。以腹泻和高架十字法为标准评价模型，观察实验大鼠出现腹泻症状。以模型大鼠进入开放臂时间（open arm time，OT）和进入开放臂次数（open arm entry，OE）在总时间和总次数统计中OT%<20%和OE%<25%，则认为焦虑模型成功（42 只被判定为成功），剔除高架十字筛选造模不合格的大鼠。

2.2 实验分组

设正常的SD 雄性大鼠为空白组A；焦虑模型大鼠随机分为5 组，每组8 只：IBS 模型组B、阳性药组（盐酸洛哌丁胺0.5 mg·kg-1）C、甘麦大枣汤低剂量组（每天一次，10 mL·kg-1）D、中剂量组（每天2 次，10 mL·kg-1）E、高剂量组（每天3 次，10 mL·kg-1）F。

2.3 实验方法和样本的取材方法

2.3.1 行为学评价实验继续维持对模型的刺激，同时按计划给药，持续15 d。最后一次给药前6 h 对各组大鼠进行高架十字法的焦虑评价，统计给药前后OT%和OE%。

2.3.2 肠推进实验与血清处理末次给药1 h 后给各组动物灌胃10%活性碳与5%阿拉伯胶混悬液（剂量10 mL·kg-1），30 min 后将实验大鼠行异氟烷麻醉、腹主动脉取血5 mL 于干燥管内，4 ℃静置1 h、4 ℃低温3000×g 离心20 min，分离出血清；编号后迅速完成5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平的ELISA检测。

将大鼠脱颈处死，剥离胃肠道，放置于平板上，测定幽门至碳墨前沿的距离，以及幽门至回盲部全长，使用公式计算肠推进百分率。

肠推进百分率（%）=炭墨前端与幽门的距离/小肠全长×100%

2.3.3 制备肠组织匀浆液和组织病理切片分离大鼠结肠组织，PBS 冲淋洗掉黏连血块，称重约0.2 g，加1.8 mL PBS 缓冲液将肠组织匀浆，制得约10%组织匀浆液，4 ℃低温、5000×g 离心10 min；取上清液编号后4 ℃冷藏备用，并取大鼠结肠组织PBS 冲淋洗掉碳墨及其他污染物，多聚焦浸泡脱水，做HE染色病理切片，观察各组病理学变化。

2.3.4 ELISA 法检测血清和肠组织中的5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平采用酶联法（ELISA），按照ELISA 试剂盒说明书所提供的标准程序，对各实验组所采集的血清样本和肠组织样本的PBS 溶液进行5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平测定，酶标仪测定吸光度，并计算出含量结果。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 甘麦大枣汤对IBS 模型大鼠焦虑行为的影响

与模型组相比，甘麦大枣汤能显著降低IBS 大鼠焦虑样行为，中、高剂量组作用显著，阳性药组作用不显著，见表1。

表1 甘麦大枣汤对IBS 大鼠焦虑样行为的影响（±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，给药前后比较，△P＜0.05。

3.2 肠推进率测量

与空白组对比，模型组肠推进率显著增加，阳性药组对IBS 模型的肠道作用显著，甘麦大枣汤可抑制IBS 的肠推动作用，但作用较阳性组弱。见表2。

表2 甘麦大枣汤对IBS 大鼠肠推进的影响（±s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.3 HE 病理结果

与空白组对比，模型组和阳性对照组大鼠结肠组织中出现肠组织水肿的病变反应，从甘麦大枣汤低剂量组中可见部分水肿反应，高剂量组和中剂量组病理组织中水肿病变明显减少。见图1。

3.4 肠组织中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

与空白组对比，IBS 模型组肠组织中SP、CGRP和TNF-α 水平均明显提高；各给药组与模型组相比均可不同程度降低大鼠肠组织中SP 和CGRP 含量，但甘麦大枣汤对血清中5-HT 和TNF-α 作用不显著，与IBS 模型组无显著差异，见表3。

表3 甘麦大枣汤对大鼠结肠组织中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影响（±s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.5 血清5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

与空白组相比，IBS 模型组血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平均明显提高；甘麦大枣汤3 组与模型组相比，均可不同程度降低大鼠肠组织中5-HT、SP 和CGRP 含量，但对TNF-α 作用不显著，与IBS 模型组无显著差异，见表4。

表4 甘麦大枣汤对大鼠血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影响（±s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

肠易激综合征不仅是一种慢性肠道功能紊乱性疾病，也是一种心身疾病，又称为肠神经官能症。据研究发现，我国IBS 发病率为5%～12%[11]，IBS 发病原因复杂，涉及胃肠道动力调节障碍、内脏感觉过敏、肠道炎症和免疫反应、精神心理因素、遗传等。临床中有42%～61%的患者存在心理障碍，常表现为广泛性焦虑、情绪低落、惊恐，同时表现出一定的躯体障碍[12]。焦虑与抑郁是最常见的精神心理障碍症状，发病机制涉及多个神经营养因子、神经递质，如5-HT、SP、CGRP 等[13]，以及下丘脑-垂体-肾上腺轴功能等。研究证实，精神心理因素是IBS 发病和治疗的关键[14]。

肠易激综合征是肠神经系统在内脏敏感和肠道动力调节紊乱等多因素所致的疾病，随着对IBS病理机制的深入研究发现，肠道平滑肌运动相关的神经调节因子以及一些炎症因子与IBS 的发生有关联性。5-HT 又叫血清素，是一种参与内脏感觉和动力调节的神经递质，主要分布于肠黏膜嗜铬细胞，血小板和脑组织也有少量分布，可以调节平滑肌张力，是肠道肌肉收缩力的重要来源，可以促进胃肠壁收缩，在IBS 患者的血清中5-HT 水平显著高于健康人群，同时，肠道中5-HT 的表达升高也伴随着嗜铬细胞的活跃程度增强，进而发生嗜铬细胞反馈合成并分泌大量5-HT，促进肠道蠕动，提高内脏敏感性，是IBS 发生泄泻的重要病理因素[15]。SP 对肠道具有增强胃肠蠕动、增加消化道平滑肌收缩，并具有刺激肠黏膜血管舒张，增加肠道分泌水和电解质的作用[16]。SP 的异常升高可使肠道平滑肌强烈收缩、增强结肠集团运动的作用，这与IBS 患者的腹痛和腹泻的症状密切相关。CGRP 的主要生理作用是促进胃肠道血流、分泌及运动功能，也可以介导痛觉的传递[6]。通过改变局部血流、调节平滑肌的收缩及肥大细胞脱颗粒，CGRP 可使内脏感觉的传入信号发生改变，可能与肠易激综合征患者的胃肠动力异常和腹痛有关[7]。IBS 患者长期腹痛和腹泻常伴有肠道的炎症反应，TNF-α 能阻止内毒素休克、有抗感染效应，是IBS 患者重要的炎症介质指标[17]。

中医学认为肝脾不调、脾失健运以及肝郁气滞是IBS 的主要病机，如《素问·藏器法时论篇》曰:“脾病者……虚则腹满肠鸣，飱泄不化。”还可因为饮食不节、外感时邪、情志失调、素体阴虚或阳虚，这些因素致使脏腑气血失调，出现气滞、血瘀，寒、湿、热等内生的一系列病理过程。辨证该病：其表现虽以脾胃为主，但病因多在肝失疏泄、肝木乘脾，致脾失健运而起。肝病多涉及人身情志，情志受到肝的疏泄功能的调节，情志不遂，肝失疏泄、肝郁气滞，则导致脾胃和肠气机郁滞升降失常，出现类似IBS 的腹痛、腹泻、便秘等症状。临床治疗除运脾化湿、调和气血外，还宜配合使用疏肝解郁、养心安神的方法来治疗肠易激综合征患者的抑郁、焦虑症状，对整体病症也有显著的疗效。甘麦大枣汤来自《金匱要略》，由甘草、小麦和大枣组方，具有补益心脾、宁心安神之功效，主要治疗因忧思过度、心神失养所致的的脏躁证，被广泛用于抑郁症、焦虑症的治疗，具有一定的疗效[18]和良好的开发潜力[8，9]。

本研究采用慢性应激诱发大鼠出现焦虑症的同时，刺激肠道平滑肌出现腹泻达到与IBS 相同的综合症状。经过15 天的模型刺激，以高架十字法筛选同时符合焦虑和肠易激特征的大鼠，然后再分组比较甘麦大枣汤对模型大鼠的干预作用。通过高架十字法的行为学实验发现，甘麦大枣汤可以显著改善IBS 大鼠的焦虑样行为，对IBS 大鼠的肠推动亢进也有一定的抑制作用。阳性对照药虽然对腹泻和肠推动的作用显著，但不能改善IBS 模型的焦虑表现。

本研究分析发现，甘麦大枣汤对IBS 模型大鼠肠组织和血清中异常升高的5-HT、SP、CGRP 均有明显降低作用，而对TNF-α 作用效果不显著。说明肠道炎性反应可能不是甘麦大枣汤的作用位点，而甘麦大枣汤在调节其他重要的肠道神经递质和中枢系统及抗焦虑抑郁状态密切，对相关细胞因子水平的作用较显著，可能是其治疗IBS 的重要机制之一。