银连祛风汤对慢性荨麻疹动物模型的治疗作用*

陶文静，李晓霞，杨军炎

1 南通汉药中医医院，南通 226001；2 如皋市人民医院，南通 226500；3 南通市第五人民医院，南通 226361

荨麻疹是一种常见的皮肤黏膜过敏性疾病，临床表现为皮肤和黏膜突然出现大小不等、形状不一的风团，境界清楚，皮疹此起彼伏，发无定处，剧烈瘙痒消退后不留痕迹，严重影响患者的生活质量。研究发现，免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型变态反应、Th1 分泌的肿瘤坏死因子-γ（TNF-γ）等细胞因子含量降低和Th2 分泌的白细胞介素4（IL-4）等的含量升高、可能是导致慢性荨麻疹发病的原因之一[1，2]。目前，治疗慢性荨麻疹西医主要采用氯雷他定、依巴斯汀和盐酸氟桂利嗪等药物治疗，但副作用大。中医认为，慢性荨麻疹病因多由风邪侵犯肌肤腠理导致营卫失调；或因饮食不节，湿热内生，复感风邪。中医治疗由多药组方协同增效、提高免疫力作用，从而降低发病率[3，4]。银连祛风汤为名中医经验方，临床上用于治疗慢性荨麻疹，取得了良好的治疗效果。为探讨其作用机制，为临床更广泛应用提供依据，现利用慢性荨麻疹动物模型考察银连祛风汤的治疗效果及作用机制。

1 实验材料

1.1 药物

银连祛风汤（处方：银花10 g，连翘10 g，生石膏30 g，生地30 g，白蒺藜20 g，土茯苓30 g，茵陈30 g，地肤子15 g，地骨皮15 g，炒僵蚕15 g，丹皮10 g，生甘皮5 g。共煎煮2 次，每次煎出液200 mL），该汤剂由南通汉药中医医院煎药室提供。人（体质量60 kg）推荐摄入量为220 g生药·d-1，相当于3.67 g生药·kg-1·d-1。地氯雷他啶分散片（海南普利制药股份有限公司），人（体质量60 kg）推荐摄入量为5 mg·d-1，相当于0.083 mg·kg-1·d-1。

1.2 试剂

卵白蛋白[默克生命科学（上海）有限公司]；氢氧化铝（AR 级，源叶生物科技有限公司）；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；IgE、TNF-γ、IL-4 试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器

Elx-800 酶标仪（美国宝特）；TGL-16C 台式离心机（上海医疗器械厂）；HH-w21-600 恒温水浴箱（上海医疗恒温设备厂）。

1.4 动物

昆明种小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半；白色豚鼠，体重（350±50）g，雌雄各半。均由南通大学医学院实验动物中心提供，小鼠合格证号：SYXK （苏）2017－046、豚鼠合格证号：SYXK（苏）2017－045。

1.5 统计学方法

使用SPSS 20.0 统计软件分析处理实验数据。统计方法采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 银连祛风汤对卵白蛋白＋氢氧化铝诱导的慢性荨麻疹模型小鼠瘙痒的影响

2.1.1 模型小鼠制备 取昆明种小鼠60 只，雌雄各30 只，雌性、雄性小鼠分别采用随机数字表将小鼠分为6 组：空白组（生理盐水）、模型组、银连祛风汤低、中、高剂量组，阳性药对照组（地氯雷他啶），且每组雌性、雄性小鼠各5 只。用氢氧化铝加生理盐水配制成氢氧化铝悬液（1 g∶1 mL），除空白组不免疫外，其余各组小鼠腹腔注射卵白蛋白与氢氧化铝悬液的混合液（0.1 mg＋0.1 mL）进行初次免疫，第10天再进行第二次免疫，共2 次[5]。

2.1.2 用药方法 各用药组小鼠在初次免疫后的第6 天开始灌胃给药。阳性对照组的药量为成人日均用量的10 倍，即0.83 mg·kg-1·d-1。取地氯雷他啶分散片10 片（50 mg），溶于1200 mL 水中备用。银连祛风汤低剂量组的药量为成人日均用量的5 倍，即18.35 g生药·kg-1·d-1；银连祛风汤中剂量组的药量为成人日均用量的10 倍，即36.70 g生药·kg-1·d-1；银连祛风汤高剂量组的药量为成人日均用量的15 倍，即55.05 g生药·kg-1·d-1。将银连祛风汤各剂量组生药分别煎煮、浓缩、定容至1200 mL 备用。用药组均灌胃对应品种和对应剂量的药物，每天1 次，每天灌胃时间为上午8：00 整开始，灌胃顺序依次为阳性药组、银连祛风汤低、中、高剂量组，模型组和空白组；均连续灌胃21 天，灌胃容量均为0.02 mL·g-1。空白组和模型组灌胃相应容量的生理盐水。

2.1.3 小鼠模型瘙痒情况 于第二次免疫后的30 min，将各组小鼠置放于安静室内，观察小鼠行为状态。数分钟后，小鼠会出现前爪搔抓头部，嘴咬躯干，后爪搔抓躯干，嘴咬尾巴等行为，该行为类似人类抓挠皮肤瘙痒状。记录30 min 内各组小鼠搔抓次数和持续时间，上述任何一动作每发生一次计作一次搔抓。结果银连祛风汤3 个剂量组均可不同程度地减少小鼠的搔抓次数，缩短搔抓的持续时间，并呈现良好的量效依赖关系，与空白组和模型组比较均有显著性差异（P<0.01）。见表1。

2.2 银连祛风汤对抗原所致豚鼠过敏性休克的影响

取豚鼠60 只，雌雄各30 只，利用随机数字表分别将雌性、雄性豚鼠分为空白组（生理盐水）、模型组、银连祛风汤低、中、高剂量组，阳性对照组（地氯雷他啶），使每组雌性、雄性豚鼠各5 只。除空白组外，模型组和各给药组豚鼠腹腔注射1∶20 小牛血清0.5 mL。7 天后，各组豚鼠灌胃给药，方法和剂量同“2.1”项下一致，连续灌胃21 天。灌胃结束后的当日15：00，在每只豚鼠的心脏再注入1∶20 小牛血清2 mL。注射后，将各组豚鼠置放于安静室内，观察豚鼠行为状态。1 小时内观察到除空白组外各组所有豚鼠均出现烦躁不安、前爪搔抓鼻子、频繁打喷嚏和咳嗽等症状，随即出现痉挛、呼吸困难、大小便失禁等症状，最后站立不稳、倒地，大部分豚鼠窒息死亡[6]。实验结果表明，各用药组均可延缓豚鼠的发敏时间，并呈现良好的量效依赖关系，与模型组比较差异有显著性（P<0.01）。银连祛风汤中、高剂量组效果更优，可有效降低实验豚鼠的死亡率。见表2。

表1 银连祛风汤对实验小鼠瘙痒的影响（±s，n=10）

表1 银连祛风汤对实验小鼠瘙痒的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01；与地氯雷他啶组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

表2 银连祛风汤对实验豚鼠过敏性休克的影响（±s，n=10）

表2 银连祛风汤对实验豚鼠过敏性休克的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01；与地氯雷他啶组比较，★P<0.01。

2.3 银连祛风汤对模型小鼠IgE、TNF-γ、IL-4 表达水平的影响

对“2.1.2”项下灌胃给药21 天后的各组小鼠摘除眼球取血2mL，室温下3.0×103r·min-1离心15min，分离血清备用。脱颈处死小鼠后，分别取每只小鼠血管壁组织约0.5 g，加2 mL PBS 缓冲液（不含钙镁）匀浆，3.0×103r·min-1离心30 min，取上清液备用。利用ELISA 法[7]检测血清及血管壁组织IgE、TNF-γ、IL-4 含量。检测结果表明，银连祛风汤3 个剂量组均不同程度地降低模型小鼠血清及血管壁组织IgE、IL-4 的含量，升高TNF-γ 的含量，并呈良好的量效依赖关系；与空白组、模型组比较均有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。检测结果还发现，血管壁组织中的各指标值改变更为明显，其中高剂量组以上各指标值基本接近正常对照组（P>0.05）。见表3、表4。

表3 银连祛风汤对实验小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表达的影响（±s，n=10）

表3 银连祛风汤对实验小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表达的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与地氯雷他啶组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

表4 银连祛风汤对实验小鼠血管壁组织中IgE、TNF-γ、IL-4 表达的影响（±s，n=10）

表4 银连祛风汤对实验小鼠血管壁组织中IgE、TNF-γ、IL-4 表达的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与地氯雷他啶组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

3 讨论

慢性荨麻疹是皮肤超敏反应性疾病，严重时可出现全身性超敏反应，甚至过敏性休克[8]。此类反应又以Ⅰ型超敏反应为主[9]。

瘙痒是慢性荨麻疹的主要临床症状之一[10]。采用卵白蛋白＋氢氧化铝制备了慢性荨麻疹小鼠模型，考察银连祛风汤缓解瘙痒症状的治疗效果。研究表明，银连祛风汤各剂量组均可明显减少小鼠搔痒的次数和搔痒的持续时间，且呈现良好量效依赖关系。表明银连祛风汤具有良好的止痒效果。

由于慢性荨麻疹可发生全身性超敏反应，利用豚鼠过敏性休克模型，考察银连祛风汤的治疗效果，结果表明该汤剂各剂量组均可延缓实验豚鼠的发敏时间，与空白对照组及模型组比较均具有显著性差异，且呈现良好量效依赖关系。其中银连祛风汤中、高剂量可降低实验豚鼠死亡率。显示银连祛风汤具有良好的抗过敏作用。

既往研究认为[11，12]，慢性荨麻疹的发生与IgE 表达水平过高有关。IgE 能够介导Ⅰ型变态反应，通过免疫应答并释放大量组胺等介质，从而引起荨麻疹的一系列症状。慢性荨麻疹患者细胞免疫功能失衡也是皮肤临床关注的热点[13]。研究发现[14]，Th1/Th2处于明显失衡状态是该病发病的原因之一，患者机体内Th1 分泌的TNF-γ、IL-2 等细胞因子明显减少，Th2 分泌的IL-4、IL-18 等细胞因子明显增加，被认为是慢性荨麻疹发病的基础[15]。推测可能是Th1 型细胞因子表达水平降低，减弱了对IgE 的抑制作用，增强Th2 型细胞因子的表达，致使IgE 合成增多，促使荨麻疹发生。因此寻找有效药物纠正失衡的Th1/Th2 细胞因子水平是临床治疗的关键点[16]。本研究发现，银连祛风汤治疗慢性荨麻疹动物模型后，瘙痒症状明显改善，血管壁组织及血清中TNFγ 含量明显升高，IgE、IL-4 含量显著降低，与文献报道具有相似性[17]。此表明银连祛风汤治疗慢性荨麻疹可能与其纠正Th1/Th2 细胞因子水平相关。

本研究还发现，血管壁组织中的各指标值改善程度要优于血清的改善程度，高剂量组中以上各指标值基本接近正常对照组。推测是慢性荨麻疹发病时由于血管通透性上升，表皮更易出现红斑、水肿等病变。经银连祛风汤治疗后，血管通透性随之降低，聚集在血管壁组织中IgE、IL-4 的水平明显下降甚至消除，TNF-γ 水平代偿性升高，并弥补其功能上的不足。而外周血由于全身循环的缘故，异常细胞因子的彻底改善会相对缓慢，出现了时间窗，类似人类慢性荨麻疹皮损已消除，但如不巩固治疗会出现反复发作现象。

祖国医学称荨麻疹为“瘾疹”，风邪侵袭是主要病因，兼有寒邪或热邪，气血不足，湿热内蕴，病程拖沓，皮肤瘙痒为疾病主症。银连祛风汤处方中银花、土茯苓清热除湿，生地、丹皮凉血养阴，同为君药，四药合用共奏清热、凉血、消风之功效；连翘、石膏清热泻火，为臣药；白蒺藜与地肤子合用增强熄风止痒之功；茵陈清热利湿；炒僵蚕息风止痉，祛风止痛；地骨皮清肺降火；生甘皮理气降逆。全方合理配伍，共奏祛风清热、凉血消风、润燥通里之功。综上所述，慢性荨麻疹的病因学说和银连祛风汤的组方原理异曲同工，并被本研究佐证。

4 结论

本研究探讨了银连祛风汤对慢性荨麻疹动物模型的治疗作用与相关机制，发现该汤剂能减少小鼠搔抓次数和搔抓的持续时间，明显延缓实验豚鼠的发敏时间，显示其具有良好地止痒和抗过敏作用。研究还发现，银连祛风汤能使模型小鼠血管壁组织及血清TNF-γ 含量明显升高，IgE、IL-4 含量显著降低，而且血管壁组织中的以上各项指标值的改善程度要优于血清的改善程度。表明对血管壁组织及血清细胞因子的调节作用可能是银连祛风汤治疗慢性荨麻疹的作用机制之一。因此本实验结果为银连祛风汤治疗慢性荨麻疹提供了重要的实验依据。