急性期川崎病IL-4基因组蛋白甲基化的改变及意义

赖 恒 王国兵 温鹏强 梅洁花 俞灵盈 徐明国 刘 琮 李成荣

川崎病(KD)是婴幼儿期多发的全身性血管炎综合征，可能与感染诱发的免疫异常有关[1-3]，但导致免疫反应异常的病因及调控机制仍未完全阐明。除炎症反应外，临床观察及动物实验表明KD存在浆细胞浸润冠状动脉瘤、B细胞数量及功能异常、自身抗体反应等，提示KD免疫发病机制可能与B细胞及其介导的体液免疫有关[4]。Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)通过促进炎症细胞因子的产生及B细胞成熟等多种机制参与调节机体免疫反应，与多种自身免疫性疾病的发病机制有关[5-7]。IL-4在Th2细胞分化及导免疫功能介导中具有极为重要的作用，是后者的标志性分子[5, 6]。但调节KD患儿IL-4基因表达及Th2细胞分化的机制尚不完全清楚。组蛋白甲基化是一种常见的表观遗传学修饰，通过改变染色质的空间构象而促进或抑制基因的转录活性[8]。本文通过分析KD患儿IL-4基因组蛋白甲基化水平及其调节信号相关分子表达变化，旨在探讨表观遗传学修饰对KD患儿IL-4表达及Th2细胞异常的影响，为KD及血管损伤的临床诊疗提供参考依据。

1 方法

1.1 医学伦理及知情同意 本研究方案经遵义医科大学深圳儿童医院(我院)伦理委员审核并获得批准(201401053)。受试者及其监护人对研究方案及内容均已知情，且自愿参与本研究。

1.2 KD及其急性KD诊断标准 依据日本川崎病研究会制定的标准[9]：①持续发热(39～40℃) ≥5 d；②手指或足指趾端硬性肿胀，第2～4周手脚掌、指趾尖或肛周可出现膜状脱屑；③全身多形性充血皮疹，无水泡及结痂；④双侧眼结膜弥漫性充血，一般无分泌物；⑤口唇或口腔黏膜变化，如草莓舌、口咽黏膜充血，嘴唇红肿、皲裂或流血；⑥颈部淋巴结非化脓性肿大，单侧或双侧，直径≥1.5 cm。①+②～⑥ 项中符合≥4项，且排除引起各项临床表现的其他疾病。急性期KD：符合KD诊断，病程≤10 d且未接受IVIG治疗。

1.3 KD冠状动脉损伤诊断标准 (1)冠状动脉扩张：冠状动脉内径<3岁>2.5 mm、～5岁>3.0 mm、≥5岁>4.0 mm；(2)冠状动脉瘤：①冠状动脉内径4.0～8.0 mm；>5岁冠状动脉扩张的内径为正常 的1.5～4倍；②巨大冠状动脉瘤：冠状动脉内径>8.0 mm；>5岁冠状动脉扩张的内径>正常4倍。

1.4 KD组纳入标准 2016年8月至2018年12月来我院就诊并诊断为KD急性期、且自愿参与本研究的KD患儿。

依据IVIG治疗前和后，分为KD-IVIG治疗前组和KD-IVIG治疗后组；IVIG治疗前后均行心脏彩色多普勒检查，根据冠状动脉损伤分为冠状动脉损伤亚组(CAL亚组)和无冠状动脉损伤亚组(NCAL亚组)。基于CAL亚组患儿年龄、性别在NCAL亚组进行匹配。

1.5 对照组纳入和排除标准 与KD同期来我院体检、且年龄、性别尽可能与KD组匹配的健康儿童，排除先天性心脏病及其他免疫性疾病等。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 IL-4、IL-5、IL-13、IL-4Rα、IL-2Rγ和SOCS5 mRNA水平检测 采用相对荧光定量PCR法：①无菌环境下采取静脉血3 mL，乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na2)抗凝，采用免疫磁珠(美国ThermoFisher公司, 11331D)分离CD4阳性细胞，并抽提、纯化总RNA；②根据试剂盒(美国ThermoFisher公司，K1632)步骤， 以总RNA为模板，经逆转录合成cDNA。③根据IL-4、IL-5、IL-13、IL-4Rα、IL-2Rγ、SOCS5及β-actin mRNA序列，采用Primer Premier 5设计、合成引物(表1)，进行35～50循环的PCR扩增，移取8 μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶孔中，90 V恒压，电泳30 min，回收、纯化后进行测序，测序结果与目的扩增片断的序列相一致。④参照试剂盒(大连Takara，RR402)步骤进行相对定量分析，检测结果以待测基因与β-actin的比值表示。

1.6.2IL-4基因组蛋白甲基化H3K4me3修饰及转录因子GATA3、甲基化酶MLL1结合水平检测 采用染色质免疫共沉淀(ChIP)：①取部分CD4+T细胞重悬于含1% 甲醛的PBS溶液， 37℃恒温下交联15 min后，离心去上清；②经预冷且含1 μg·mL-1pepstatin A, 1 μg·mL-1aprotinin和1 mM PMSF的PBS溶液洗2次后，加入200 μL SDS裂解液重悬，0℃孵育15 min; ③采用超声波将基因组DNA剪切为400～600 bp后，分别加入抗GATA3、MLL1和组蛋白H3K4me3单克隆抗体，分离、纯化抗体结合DNA和input DNA；④根据IL-4基因组蛋白H3K4me3修饰位点序列，采用Primer Primier 5设计引物，参照试剂盒(大连Takara，RR402)步骤进行相对定量分析，检测结果以抗体结合DNA与input DNA比值表示。

1.6.3 血浆细胞因子IL-4、IL-5和IL-13蛋白浓度检测 采用双抗体夹心ELISA：KD患儿及正常健康对照者空腹6 h后，取2 mL外周血，以肝素抗凝， 300×g离心15 min，移取上层血浆，-80℃保存备用；根据试剂盒(美国eBioscience公司，BMS225-2、BMS278、BMS231-3)说明，检测血浆细胞因子IL-4、IL-5和IL-13蛋白浓度。

1.6.4 Th2细胞比例及IL-4、pSTAT6、GATA-3蛋白水平检测 采用流式细胞直标法检测：①取1 mL抗凝外周血，经密度梯度离心法分离PBMC，按1×106·mL-1重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基；②加入终浓度为1 μg·mL-1Ionomycin、300 ng·mL-1PMA和2 μmol·L-1Monensin，于5% CO2、37℃下刺激培养6 h；③经CD4-eFluro450、IL-4-Alexa488、pSTAT6(Tyr641)-APC、GATA-3-PE-Cy7荧光标记的单抗染色30 min后，采用Diva软件分析CD4+IL-4+(Th2)细胞比例及CD4+T细胞IL-4、pSTAT6、GATA-3蛋白表达水平。其中，蛋白表达水平以平均荧光强度(MFI)表示。

表1 RT-PCR及实时荧光定量PCR引物

2 结果

2.1 一般情况 42例进入本文分析，男22例、女20例，年龄1～5.3(2.9±1.3)岁；CAL亚组18例，男10例、女8例，年龄1～5.1(2.8±1.2)岁; NCAL亚组24例，男12例、女12例，年龄1～5.3(3.0±1.4)岁。健康对照儿童36例，其中男19例，女17例，年龄1.2～4.8(2.8±1.2)岁。年龄KD组和健康对照组(t=0.35,P=0.73)、CAL亚组和NCAL亚组(t=0.46,P=0.65)差异均无统计学意义，性别KD组和健康对照组(χ2=0.001,P=0.97)、CAL亚组和NCAL亚组(χ2=0.127,P=0.72)差异均无统计学意义。

2.2 Th2细胞比例、功能相关分子及组蛋白甲基化相关分子表达检测 表2和3显示，与正常健康对照组相比，KD患儿急性期Th2细胞比例、功能相关分子IL-4、IL-5、IL-13 mRNA表达及血浆蛋白水平显著增高(P<0.05)，其中CAL亚组均明显高于NCAL亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后明显下降(P<0.05)，图1为Th2细胞(A)及其相关分子(B)流式细胞检测结束。

图2显示，各组IL-4基因组蛋白甲基化H3K4me3修饰变化，KD组IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点组蛋白甲基化H3K4me3修饰水平显著增加(P<0.05)，且CAL亚组CNS1、HSⅡ和HSVa位点H3K4me3修饰水平均高于NCAL亚组，经IVIG治疗明显下调 (P<0.05)。

表2 Th2细胞亚群及IL-4基因组蛋白甲基化相关分子流式检测结果

注 1)：与对照组比较，P<0.05；2)：与NCAL组比较，P<0.05；3)：与KD组比较，P<0.05；KDIVIG组：IVIG治疗后的KD组

表3 血浆细胞因子ELISA检测结果

注 1)：与对照组比较，P<0.05；2)：与NCAL组比较，P<0.05；3)：与KD组比较，P<0.05；KDIVIG组：IVIG治疗后的KD组

图1Th2细胞及相关分子流式细胞术检测结果

图2IL-4基因组蛋白H3K4me3修饰及相关因子结合水平检测结果

注 1)：与对照组比较P<0.05；2)：与NCAL组比较P<0.05；3)：与KD组比较P<0.05

表4 IL-4基因组蛋白甲基化相关分子荧光定量PCR检测结果

注 与Ctrl组比较，1)：P<0.05；与NCAL组比较；2)：P<0.05；与KD组比较；3)：P<0.05；KDIVIG组：IVIG治疗后的KD组

2.3 IL-4组蛋白甲基化修饰相关的转录因子、组蛋白甲基化酶检测 经染色质免疫共沉淀检测IL-4基因组蛋白甲基化相关分子的结合水平，观察到KD组外周血CD4+T细胞转录因子GATA3、组蛋白甲基化酶MLL1与IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点的结合水平显著上调(P<0.05)、且MLL1结合水平与IL-4基因mRNA表达呈正相关关系(r=0.42、0.33、0.39,P<0.05)，经IVIG治疗后均表现不同水平的降低(P<0.05)。比较CAL亚组和NCAL亚组GATA3、MLL1与IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点结合水平均明显高于NCAL亚组 (P<0.05) 。

2.4 细胞因子IL-4信号相关分子及负性调节因子检测 KD患儿急性期血浆IL-4浓度、CD4+T细胞IL-4Rα、IL-2Rγ表达水平显著增高(P<0.05)，且CAL亚组IL-4浓度及IL-4Rα、IL-2Rγ表达均高于NCAL亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后明显下降(P<0.05)(表3和4)。进一步分析IL-4R受体下游信号分子及负性调节因子的表达，KD组CD4+T细胞pSTAT6、GATA3、SOCS5表达显著上调，其中CAL亚组pSTAT6、GATA3表达高于NCAL亚组、SOCS5表达低于NCAL亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后均表现出不同水平的降低(P<0.05)(表2和4)。

3 讨论

KD是一种自身免疫性血管炎综合征，其病因及发病机制尚不完全清楚，可能与感染导致的急性自身免疫功能异常有关[1-3]，但导致KD自身免疫紊乱的机制仍未完全阐明。Th2细胞是一类CD4+T细胞亚群，通过分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子促进B细胞成熟及抗体类型转换而介导体液免疫，并与多种自身免疫性疾病的发病机制有关[5-7]。本研究KD患儿急性期Th2细胞比例、功能相关因子IL-4、IL-5、IL-13 mRNA表达及血浆蛋白水平显著增加，且CAL亚组前述各项指标均明显高于NCAL亚组，经IVIG治疗后显著降低，提示Th2细胞数量及功能异常可能与KD患儿免疫功能紊乱有关。

细胞因子IL-4不仅是Th2细胞的功能介导因子，还在调节其分化、成熟的分子机制中发挥着极为关键的作用[5, 6]。大量研究表明，多种因素如细胞因子信号、表观遗传学修饰等参与调节IL-4基因表达[8, 10, 11]。组蛋白甲基化是一种表观遗传学修饰方式，通过组蛋白甲基转移酶将甲基转移至组蛋白中特定的氨基酸残基，促使核小体外围的染色质丝发生空间构象变化，进而促进或抑制基因的转录活性。其中，H3K4me3修饰促进基因转录[12-14]。本研究中， KD患儿急性期IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点组蛋白甲基化H3K4me3修饰水平显著增加，经IVIG治疗显著降低。进一步分析显示，CAL亚组CNS1、HSⅡ和HSVa位点H3K4me3修饰水平均高于NCAL亚组，提示KD患儿急性期Th2 细胞数量及IL-4表达异常可能与组蛋白H3K4me3过度修饰有关。

调节IL-4基因组蛋白甲基化的分子机制尚不完全清楚。GATA3是Th2细胞的关键转录因子，可与IL-4基因CNS1、HSⅡ和HSVa位点结合并募集组蛋白甲基转移酶MLL1，后者促使前述3位点发生组蛋白甲基化H3K4me3修饰，进而增强GATA3介导的IL-4基因转录[10, 15]。本研究显示，急性期KD患儿GATA3、MLL1与IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点的结合水平显著上调、且MLL1结合水平与IL-4基因mRNA表达呈正相关，经IVIG治疗后均表现不同水平的降低。比较CAL亚组和NCAL亚组前述各项指标，发现CAL亚组GATA3、MLL1与IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位点结合水平均明显高于NCAL亚组，提示GATA3/MLL1过度结合可能是导致KD患儿急性期IL-4基因组蛋白H3K4me3修饰异常的重要原因。 IL-4可与靶细胞表面IL-4R(IL-4Rα/IL-2Rγ)结合，诱使JAK1/3发生磷酸化，激活JAK/STAT6信号途径。JAK激酶磷酸化STAT6，后者形成二聚体并转位入核，启动GATA3表达[16]。SOCS5负性调节JAK/STAT6信号，进而抑制GATA3的表达[17]。为深入了解导致KD急性期患儿GATA3/MLL1与IL-4基因过度结合的调节机制，本研究进一步比较IL-4信号分子的表达，发现KD患儿急性期血浆IL-4浓度及细胞表面受体IL-4Rα、IL-2Rγ表达水平显著增高，且CAL亚组IL-4浓度及IL-4Rα、IL-2Rγ表达均高于NCAL亚组，经IVIG治疗后均明显下降。分析IL-4R受体下游信号分子及负性调节因子的表达，注意到KD患儿急性期pSTAT6、GATA3、SOCS5表达显著上调，其中CAL亚组pSTAT6、GATA3表达高于NCAL亚组、SOCS5表达则低于NCAL亚组，经IVIG治疗后表现出不同水平的降低，提示IL-4信号异常活化及负性调节因子SOCS5表达相对不足可能是导致KD患儿急性期GATA3/MLL1与IL-4基因过度结合的关键因素。

综合上述结果，推测KD患儿急性期IL-4信号过度活化及负性调节因子SOCS5表达相对不足，促使转录因子GATA3过表达，后者与IL-4基因结合并募集组蛋白甲基化酶MLL1，介导IL-4基因组蛋白甲基化H3K4me3修饰水平及转录活性上调，从而形成正反馈效应及IL-4过度表达，最终导致Th2细胞数量及功能异常活化。但组蛋白甲基化是一种涉及多种信号及调节因子的复杂反应，未来仍需进一步研究是否存在其他因素参与调节IL-4基因组蛋白甲基化。