基于决策曲线和剂量反应分析评估腺病毒载量对儿童感染重症腺病毒肺炎后发展为闭塞性细支气管炎的预测价值

廖 蔻 代继宏 钟林平 林继雷

闭塞性细支气管炎(BO)是一种少见的由小气道损伤后炎症及纤维化病变所引起的临床综合征，以小呼吸道阻塞和气流受限为特点。多见于儿童，临床以重症肺炎或其他原因引起的进行性呼吸困难及气流受阻为主要表现，预后不良。感染是引起儿童 BO 的最常见原因[1,2]，腺病毒(ADV)感染是公认的引起儿童BO的主要病原[3]。

ADV是一种DNA病毒，主要通过呼吸道传染，是儿童常见的呼吸道感染的病原体，其中重症腺病毒肺炎(SAP)占重症肺炎19.3%[4]。SAP主要表现为发热时间长、呼吸道症状重、易发生多系统并发症、病死率高，且近期ADV流行在全国范围内升高，引起了大家对SAP的高度重视。有研究表明SAP患儿易遗留慢性气道和肺疾病，其中BO的发生率高达47.4%[5]。但是目前对于SAP发展为BO的危险性尚无有效预测指标。有研究表明ADV载量与肺炎的严重程度呈正相关,ADV载量可显著增加重症肺炎的风险，具体机制不清[6]。

1 方法

1.1 研究设计 通过病例对照研究确立SAP发展为BO的危险因素，并对危险因素行关联强度分析，通过决策曲线分析预测临床价值。

1.2 诊断标准

1.2.1 腺病毒肺炎诊断标准[7]①体温常持续≥39℃，可伴咳嗽、喘息，②肺部可有细湿啰音或哮鸣音，③鼻咽抽吸物核酸检测显示ADV阳性(>400拷贝·mL-1)。

1.2.2 重症肺炎诊断标准[8]存在以下任何一项，①一般情况差，②拒食或脱水症，③意识障碍，④呼吸频率明显增快(婴儿>70·min-1；年长儿>50·min-1)，⑤紫绀，⑥呼吸困难(呻吟、三凹征、鼻翼扇动)，⑦肺浸润(多肺叶或≥2/3的肺受累)，⑧胸腔积液，⑨经皮血氧饱和度≤0.92，⑩肺外并发症(脑膜炎、脑脓肿，心包炎、心内膜炎，骨髓炎，关节炎，脓毒症，溶血尿毒症综合征等)。

1.2.3 BO临床诊断标准[2]①持续或反复喘息或咳嗽、呼吸急促、呼吸困难、运动不耐受，②双肺可闻及广泛哮鸣音、湿啰音，并持续>6周，对支气管舒张剂反应差，③高分辨率CT显示BO改变(如马赛克征、支气管扩张、支气管壁增厚)；④肺功能显示小气道阻塞性通气功能障碍或混合型通气功能障碍，支气管舒张实验多为阴性。

1.3 纳入标准 2015年1月至2019年2月重庆医科大学附属儿童医院(我院)住院治疗的1～18岁SAP(符合腺病毒肺炎诊断同时符合重症肺炎标准)患儿，出院后半年明确是否符合BO临床诊断标准，且排除其他引起咳嗽的疾病(如支气管哮喘、各种先天性肺发育畸形、肺结核、弥漫性泛细支气管炎等)。

1.4 排除标准 ①患SAP前已诊断BO者，②既往有骨髓移植或心肺移植者，③出院后诊断BO前再次感染其他病原体导致重症肺炎者，④住院期间未行胸部CT检查，⑤住院期间死亡或自动出院者，⑥无法明确是否发展为BO，如失访，或出院半年有可疑症状(反复咳嗽或喘息)但监护人拒绝完善胸部CT检查明确诊断。

1.5 分组考虑 随访半年发展为BO为BO组，未发展为BO为非BO组。

1.6 资料截取 鉴于本文通过LASSO回归筛选变量，以最低离均差的一个标准差作为选取变量的标准，再纳入多因素Logistic回归分析，因此尽可能多的从住院病志中提取患儿临床特征。性别，年龄，早产，剖宫产，影像学检查报告提示的先天性气道发育异常和先天性心脏病，营养不良，是否反复高热(病程中每天发热>3次，最高体温≥39℃)，发热持续时间，呼吸衰竭，CT报告显示节段性肺实变、肺不张、胸腔积液、肺坏死，住院期间的实验室指标截取最大异常值(血WBC、L%、Hb、PLT、ALT、AST、ALB、LDH、CRP、PCT、AVD载量)，是否因SAP使用丙种球蛋白>400 mg·kg-1，是否因SAP静脉使用糖皮质激素，是否诊断呼吸衰竭(血气分析提示氧饱和度<50%，或者在鼻导管给氧和面罩给氧下仍有进行性呼吸困难)，是否因SAP行有创机械通气，是否有消化系统并发症，如腹泻、呕吐、中毒性肠麻痹等，是否有心血管并发症，如心包炎、心内膜炎、心肌损伤、心律失常等，是否有血液系统并发症，如继发性血小板增多症、凝血功能障碍、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症等，是否有神经系统并发症，如中毒性脑病或脑炎等，是否合并细菌感染，如痰培养细菌阳性，是否合并病毒感染，如呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型及乙型流感病毒和副流感病毒1、2、3型阳性，是否进入ICU。

1.7 病毒检测 入我院后24 h内获得受试者的鼻咽抽吸物，利用间接免疫荧光病毒检测ADV、RSV、流感和副流感病毒；采用聚合酶链反应检测ADV载量HAdV和支原体感染。

1.8 统计学方法 所有数据均采用R 3.60软件进行统计学分析，本研究因ADV拷贝数个体差异较大，故取其自然对数进行计算。正态分布计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；偏态分布计量资料以中位数(四分位距)表示，组间比较采用Mann．WhitneyU检验。计数资料以率或百分比表示，组间比较采用卡方检验。利用Lasso Logistic回归模型进行变量选择，通过交叉验证选择模型中最优调和参数λ，分析筛选SAP发展为BO的影响因素。再用logistic多元回归分析纳入多个因素，再以ADV载量为诊断指标，绘制ROC曲线，寻找ADV载量最佳截断值；以该截断值为参考值，应用样条函数与logistic回归相结合的限制性立方样条法分析ADV载量与SAP发展为BO的剂量反应关系，其中ADV载量为连续变量，根据其百分位数的分布截取4个节点( P5，P35，P65，P95)，在R 3.6软件中绘制限制性立方样条图。最后对ADV载量进行决策曲线分析，以净获益率为纵坐标，高风险阈值为横坐标，绘制决策的临床分析(DCA)和临床影响分析(CIA)曲线。同时本研究采用Spearman相关分析探索ADV载量与CRP及LDH之间的关系。

2 结果

2.1 一般情况 通过我院病案系统检索符合本文纳入标准的222例SAP患儿，排除出院后半年内再次感染其他病原体导致重症肺炎6例，住院期间死亡10例，家属要求自动出院9例，住院期间缺少胸部CT资料12例，出院后失访28例，有可疑症状但无法明确BO诊断18例。139例SAP患儿进入本文分析，BO组34例，非BO组105例。表1显示两组人群的临床特征。

表1 SAP患儿中BO组和非BO组临床资料比较[n(%)]

2.2 ADV载量与发展为BO的关系 选择经单因素分析差异有统计学意义的18个指标作为自变量，SAP是否发展为BO作为因变量，行Logistic回归分析。利用Lasso logistic模型分析，通过交叉检验法选择最佳λ值。折叠次数为10次(图1A)。纵坐标代表目标参量，下横坐标代表log(λ)，上横坐标是该模型中非零系数变量的个数，因为交叉验证，对于每个λ值，在红点所示目标参量的均值左右，可得到一个目标参量的置信区间。图1两条虚线代表两个特殊的λ值即Lambda.min和Lambda.1se。Lambda.min指所有λ中得到最小目标参量均值的λ值，Lambda.1se指Lambda.min一个方差范围内得到最精简模型的λ值。本研究选取Lambda.1se的值为0.084，此时进入模型的变量有：发热持续时间、是否有创机械通气、ADV载量和LDH。

图1B显示，随着λ值的变化模型变量的筛选情况，每条曲线代表每一个自变量系数的变化轨迹，纵坐标是系数的值，下横坐标是 log(λ) ，上横坐标是此时模型中非零系数的个数。随着 λ 值增大，模型压缩程度越大，进入模型的自变量个数减少，模型选择主要变量的功能变强。通过对筛选入的变量行多元logistic回归分析表明，ADV载量是SAP发展为BO的独立危险因素(OR=1.247，95% CI：1.088～1.459，P=0.01)。

2.3 ADV载量对SAP发展为BO的诊断价值 以ADV载量为诊断指标，行敏感度和特异质分析，图1C显示，ROC曲线下面积(AUC)=0.712(95%CI：0.61～0.81)。约登指数最高时的ADV载量的自然对数为17.2设置为最佳截断值，预测SAP发展为BO的敏感度69.5%，特异度67.6%。

2.4 ADV载量与SAP发展为BO关联强度的剂量反应分析 以ADV载量自然对数值最佳截断值17.2为参考值，应用样条函数与logistic 回归相结合的限制性立方样条法分析ADV载量与SAP发展为BO的剂量反应关系，图1D中横坐标为ADV载量自然对数的连续变化，纵坐标为相对应的预测值(OR)，阴影部分表示95%CI。ADV载量连续变化与SAP发展为BO的关联强度呈线性剂量反应关系(线性检验，P=0.69)。

2.5 ADV载量与SAP发展为BO的决策曲线分析 以净获益率为纵坐标，高风险阈值为横坐标，绘制DCA曲线，其中高风险阈值设为(0,1)。图1E显示，当高风险阈值为0.1～0.45时，净获益率>0，且有临床意义，提示ADV载量对SAP发展为BO的预测有重要临床价值。临床影响曲线分析图1F显示，为假设1 000个病人用ADV载量去预测得到的预测患病人数和实际患病人数相比情况，高风险阈值>0.3预测值和实际值较接近。

2.6 ADV载量与炎症的关系 因ADV载量、CRP和LDH均不符合正态性分布，故通过Spearman秩相关性分析，ADV载量与CRP存在相关性(r=0.2，P=0.02；ADV载量与LDH也存在相关性(r=0.23，P= 0.005) 。

图1ADV载量与发展为BO的诊断价值及其决策曲线

注 A：Lambda与模型误差；B：Lambda 与变量的解路径；C：ADV载量的ROC曲线下面积；D：基于限制性立方样条模型分析的ADV载量与SAP为BO的剂量反应关系；E：ADV载量的DCA曲线；F：临床影响曲线分析

3 讨论

对于儿童,ADV感染是导致重症肺炎的主要病因，可出现严重肺部症状甚至多器官功能障碍，病死率高达10%，存活者有14%～60%遗留有难以逆转的肺部后遗症[9]。一项研究对45例住院的腺病毒肺炎婴儿进行了前瞻性评估，并进行了5年随访，大多数儿童在2岁之前就感染了ADV，在随访的5年中，几乎一半患儿发展为BO[5]。一项研究显示，在对PBO预后分析中，有42%的患者仍反复喘息发作，32%的支气管扩张和21%的胸廓畸形[10]，总体预后不良[11-12]。

本文研究139例SAP儿童，34例发展为BO，发现两组患儿发热持续时间、呼吸衰竭、有创机械通气、鼻咽抽吸物ADV载量、PCT、合并细菌感染差异均有统计学意义(P均<0.05)，说明了SAP发展为BO受多个因素影响可能，其中合并感染是潜在的危险因素。通过对筛选的变量行多元logistic回归分析表明，鼻咽抽吸物ADV载量是SAP发展为BO的独立危险因素(OR=1.247，95% CI 1.088～1.459，P<0.05)，ROC曲线下面积为0.712，表明ADV载量预测SAP发展为BO的准确性为较高。

本研究就对ADV载量与SAP发展为BO的关联进行研究分析。结果显示，ADV载量与SAP发展为BO之间大致呈显著的正相关。而且还采用了决策曲线直观地评估ADV载量对SAP发展为BO预测的临床获益,结果提示ADV载量对SAP发展为BO的预测有重要临床价值。因此，当临床上SAP患儿ADV载量越高，发展为BO的可能性越大，应尽早进行干预治疗，预防SAP发展为BO。因此对于SAP患儿，实时监测ADV载量的变化是至关重要的。

目前机体过强免疫炎性反应是对SAP发展到BO的一个公认的重要因素，本文中发现BO组患儿CPR、LDH明显高于非BO组，但ADV载体增高具体如何引起过高的炎症反应目前并不明确。有研究显示ADV载量与肺炎严重程度相关[6]；有研究显示呼吸道合胞病毒(RSV)载量与RSV感染的疾病严重程度有关，且病毒的感染，高峰和清除与疾病的发作，高峰和清除存在密切的时间关联，支持了通过抗病毒化合物实现病毒载量的大幅降低而产生的潜在临床有效性[13]。本文推测可能在儿童ADV肺炎中，ADV载量不仅影响肺炎的严重程度，同时导致更明显的炎症。本研究发现BO组CRP、LDH明显高于非BO组，在对ADV载量与LDH和CRP进行了相关性分析后发现ADV载量与CRP(r=0.2，P<0.05)和LDH均有相关性(r=0.23，P<0.05)。本研究通过LASSO回归并未纳入CRP和LDH，从侧面也反应了应用LASSO回归筛选变量能解决模型的共线性问题，从而更加肯定ADV载量作为一个独立的危险因素影响BO的发生。