HPLC测定莲不同部位紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量
2019-12-30裴香萍李慧峰杜晨晖刘海霞张淑蓉
裴香萍 李慧峰 杜晨晖 刘海霞 张淑蓉
摘要:目的 建立莲不同部位中紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量的HPLC测定方法。方法 采用Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.5%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长347 nm,流速0.8 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL。结果 在上述色谱条件下,紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷与相邻色谱峰的分离度良好。紫云英苷在0.100 5~2.01 μg范圍内有良好的线性关系(r=0.999 6),平均加样回收率为100.96%(RSD=2.68%);异鼠李素-3-O-葡萄糖苷在0.026~0.52 μg范围内有良好的线性关系(r=0.999 4),平均加样回收率为98.91%(RSD=2.34%)。结论 本研究建立的方法操作简便,结果可靠,可为莲相关药材的质量控制及资源开发提供依据。
关键词:莲;紫云英苷;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷;高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2019)12-0075-04
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.016 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Content Determination of Astragalin and Isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo Nucifera Gaertn. by HPLC
PEI Xiangping1, LI Huifeng1, DU Chenhui1, LIU Haixia2, ZHANG Shurong1
1. Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030600, China; 2. Shanxi Zhendong Ante Biological Pharmaceutical Co., Ltd., Jinzhong 030600, China
Abstract: Objective To establish an HPLC method for content determination of astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo nucifera Gaertn. Methods The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18 column (200 mm × 4.6 mm, 5 μm); the column temperature was maintained at 30 ℃; the mobile phase was acetonitrile-0.5% formic acid solution as gradient elution; the flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was at 347 nm; the injection volume was 10 μL. Results Under above chromatographic conditions, astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside with adjacent other peaks were among the good separation. Astragalin had a good linear relationship in the range of 0.1005–2.01 μg (r=0.999 6); the average recovery was 100.96% (RSD=2.68%). Isorhamnetin-3-O-glucoside had a good linear relationship in the range of 0.026–0.52 μg (r=0.999 3); the average recovery was 98.57% (RSD=2.34%). Conclusion The method is convenient and reliable, which can provide evidence for the quality control and resource development of Nelumbo nucifera Gaertn. as a related medicine.
Keywords: Nelumbo nucifera Gaertn.; astragalin; isorhamnetin-3-O-glucoside; HPLC; content determination
莲Nelumbo nucifera Gaertn.为睡莲科多年生宿根草本植物,兼具食用和藥用价值,主要含有生物碱类、黄酮类、花青素、挥发油类、有机酸、甾醇、挥发油及微量元素等[1],具有降脂、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗惊厥、保肝等药理作用[2-4]。我国莲的种植基地主要分布于江西、福建、湖南、湖北、浙江、河北等地,
基金项目:山西省中药材、中药饮片地方标准研究(2011007A);山西中医药大学科技创新团队(2018TD009)
其中莲子、莲藕以食用为主,荷叶、莲花、莲梗、莲房、莲子心以药用为主。目前莲房、莲须、莲子、莲子心、荷叶收载于2015年版《中华人民共和国药典》(一部)[5],对荷叶中荷叶碱、莲子心中的莲心碱成分进行了定量控制,而对莲花、莲梗、莲房的含量测定研究报道相对较少。为控制相关药材质量,本研究对莲不同部位(莲花、莲梗、莲房、荷叶)中的紫云英苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷进行含量测定,为其药食价值利用及资源开发奠定基础。
1 仪器与试药
Waters 2695高效液相色谱仪,Empower工作站,Waters 2998检测器(美国Waters公司);ZF-90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂);XS205DU电子分析天平(梅特勒?托利多仪器有限公司)。
莲花共13批,7批为开放的花(购于药材市场),6批为花蕾(自采);荷叶6批,莲房6批,莲梗6批。经山西中医药大学杜晨晖副教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuciera Gaertn.。样品来源信息见表1。紫云英苷对照品(批号MUST-12092001,纯度>98.0%),成都曼斯特生物有限公司;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品(批号140917,纯度>98.0%),中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为乙腈、B为0.5%甲酸溶液,梯度洗脱(见表2),柱温30℃,流速0.8 mL/min,检测波长347 nm,进样量10 μL。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
取异鼠李素-3-O-葡萄糖苷2.6 mg,置于5 mL容量瓶中,加乙醇制成每1 mL含0.52 mg的溶液;取紫云英苷对照品适量,加乙醇制成每1 mL含2.01 mg的溶液,备用。
另取异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液1 mL、紫云英苷对照品溶液1 mL,稀释至10 mL容量瓶中,得混合对照品溶液(每1 mL含紫云英苷0.201 mg、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.052 mg)。
2.3 供试品溶液制备
取样品,粉碎成粉末(过3号筛),精密称取莲花样品0.5 g,莲房、荷叶样品各3 g,置烧瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,称定质量,加热回流1 h,放冷,再次称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。
2.4 线性关系考察
精密量取混合对照品溶液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、2.0 mL于2 mL容量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀。精密吸取10 ?L,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积积分值。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程。紫云英苷:Y=2 617 223.380 0X+87 318.167 1,r=0.999 6,线性范围为0.100 5~2.01 ?g;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷:Y=3 795 683.72X+47 996.58,r=0.999 4,线性范围为0.026~0.52 ?g。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液(紫云英苷0.080 4 mg/mL、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.020 8 mg/mL)10 ?L,连续进样6次,测定峰面积积分值,计算得RSD分别为1.13%、0.97%,表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一供试品溶液10 ?L,在上述色谱条件下,分别于0、2、4、8、10、12 h进样,记录色谱峰峰面积积分值,计算得紫云英苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷峰面积RSD分别为1.24%、1.73%,表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一批莲花样品(批号160816),按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液,精密吸取10 ?L,分别测定峰面积积分值,并计算含量。结果样品中紫云英苷元平均含量为0.349%,RSD=2.52%;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均含量为0.064%,RSD=2.34%。表明本法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的莲花供试品(批号160816)0.25 g,研细,精密称取6份,分别精密加入1 mL混合对照品溶液(紫云英苷0.87 mg/mL,含异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.16 mg/mL),按“2.3”项下方法制备,进样10 μL测定,计算回收率。结果紫云英苷平均回收率为100.96%,RSD=2.68%;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均回收率为98.91%,RSD=2.34%。见表3、表4。
2.9 样品含量测定
取样品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,进样测定,以外标法计算含量,结果见表5。
3 讨论
本试验莲花样品同时收集了花蕾和开放的花。测定结果表明,于药材市场购买的莲花中紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量较高,其多为已开放的花,主要为花瓣;而自采样品均为未开放的花蕾,其紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量相对较低,可能由于花蕾中莲房、雄蕊、雌蕊占有一定比例。测定结果也表明,莲房、莲梗样品中2种成分含量最低。可见,紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等黄酮类成分主要集中于莲花的花瓣中。这与文献报道黄酮类化合物主要存在于荷叶及莲花中[6-7]一致。因此,临床用药及资源开发中应注意对莲的不同部位区别应用。
莲花在文献记载中多以花蕾入药,《山西省中药材标准(一九八七年版)》[8]、《湖南省中药材标准(2009年版)》[9]、《山东省中药材标准(2002年版)》[10]均以花蕾入药,《北京市中药饮片标准(二OO年版)》[11]以花蕾或将开放的花入药,《福建省中药材标准(2006年版)》[12]以花蕾或花入药。但安徽亳州药材市场、河北安国药材市场调研及所购买的莲花主要为花瓣,几乎不含有莲房部位;样品采集过程中,种植户反映夏季采集未开放的花蕾会影响秋冬季节莲藕的产量。因此,对于药食两用植物莲的开发应全方位综合考虑,既要关注某些部位的药用价值,也应注重更广泛的食用价值。另外,对于莲的不同部位,适宜的采收时间是保证其质量的主要因素,在相关标准中应予以明确规定。
本试验考察了不同的提取溶剂,分别以甲醇、无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇作为提取溶剂,结果表明,用70%乙醇提取后,紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量较高,故以70%乙醇作为提取溶剂。试验还考察了室温冷浸24 h、超声提取30 min、超声提取60 min、回流提取1 h等不同提取方法,结果表明,回流提取1 h的样品中紫云英苷含量较高,故提取方法选择回流提取1 h。
本试验参考相关文献报道[13],比较了乙腈-0.2%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例作为流动相,后经多次试验摸索,确定了乙腈-0.5%甲酸水溶液的梯度分离条件,使各色谱峰达到基线分离,与相邻色谱峰分离度均大于1.5,紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷理论塔板数均大于3000,对称因子均在0.95~1.05之间。
参考文献:
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(收稿日期:2019-02-15)
(修回日期:2019-03-06;编辑:陈静)