一株嗜酸乳杆菌的分离与鉴定

2019-12-30吴家鑫史旭军刘沛溢

生物加工过程 2019年6期

吴家鑫，王峥，史旭军，刘沛溢，苏宁，闫妍，王瑞

(1.北京化工大学生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029；2.桂林长发小寨生物科技有限公司，广西桂林 541000；3.北京佰草国颐堂医学研究院，北京 100012；4.中国检验检疫科学研究院化妆品技术中心，北京 100176)

微生态学(Microexology)由德国Rush博士于1977年首次明确提出，在微生物学基础上吸收了生物学思想而发展起来，主要研究正常微生物群与其宿主相互依赖、相互制约的边缘学科，是细胞水平或分子水平的生态学[1]。人体体表和体腔存在大量的微生物种群，它们分别定植于胃肠道、口腔、皮肤、呼吸道、泌尿道等，与其生存的微环境共同构成人体微生态系统[2]。

目前的微生态研究主要集中于胃肠道系统，随着近年来的逐步深入，人们逐渐意识到皮肤微生态的变化可能会导致皮肤出现问题甚至疾病[3]。皮肤表面具有多种菌群，通常可以分为常驻菌和暂住菌[4]。暂住菌通过接触外界环境获得，常常会引起皮肤感染；常驻菌是在健康皮肤表面定居的微生物，具有多种调节功能[4-5]。常驻菌可以通过调控皮肤角质形成细胞表达抗菌肽来抵御外界病原菌在皮肤表面的生长[5]，可以直接分泌抗菌肽抑制病原菌定植[6]，可以分解角质细胞的碎屑或脂质，维持表皮的酸性环境，有效地抵御外界病原菌的入侵[7]，可以间接调节机体免疫反应[8]。

桂林市黄洛瑶寨地区人群在洗发过程中长期使用淘米水发酵液，对发质和头发根部头皮具有良好的养护作用，为了深入研究发酵淘米水中菌株对头发和头皮微生态的影响，对淘米水发酵液进行菌株的分离与鉴定，得到3株嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)疑似菌株，通过菌株的菌落形态、显微形态、生理生化试验、分子生物学试验进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

淘米水发酵液，来源于广西壮族自治区桂林市龙胜县龙脊镇金江村黄洛瑶寨(长发村)。

LBS琼脂培养基[9]，MRS培养基[9]，营养琼脂(NA)培养基[9]，沙氏琼脂(SDA)培养基[10]，MC培养基[11]。

DNA快速提取试剂(PrepMan Ultra)、琼脂糖、PCR试剂(Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTP Mixture，rTaqDNA polymerase，重蒸水等)、ExoSAP-IT PCR产物纯化试剂盒、测序试剂(BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer)、BigDye XTerminator Purification Kit纯化试剂盒、革兰氏染色液，Invitrogen公司；莫匹罗星锂、半胱氨酸盐酸盐，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设备

Eppendorf Research plus移液器(1 000 μL、200 μL 、100 μL、10 μL)、Eppendorf MixMate涡旋振荡器、Centrifuge5810R型离心机，Eppendorf公司； PowerPac Basic电泳仪、VersaDoc MP 4000 型凝胶成像仪，Bio-Rad公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR仪，Thermo Fisher公司；AB3500、AB3130型基因分析仪，ABI公司；DM2500型光学显微镜，Leica公司；Esco AC2-4S1型二级生物安全柜，Esco公司；DHP-9272B型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；AW 300SG型厌氧培养箱，ELECTROTEK公司；HPP260型恒温恒湿培养箱，MEMMERT公司；BD Phoenix 100型全自动微生物检定仪，BD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离纯化

将淘米水发酵液进行梯度稀释，将冷却至约50 ℃的LBS琼脂培养基倒入灭菌后的培养皿中，待其凝固，待用。取1.0 mL合适稀释度的稀释液置于LBS固体培养基上涂匀，37 ℃厌氧培养36～48 h。

在LBS琼脂平板上，挑取具有乳酸菌典型特点并且生长旺盛的单菌落，通过革兰染色后，挑取含有革兰阳性菌的单菌落在LBS琼脂平板上再次进行划线培养，37 ℃厌氧培养36～48 h，重复分离纯化培养至少3次。

在MRS琼脂平板上划线分离纯化革兰阳性菌单菌落，37 ℃厌氧培养36～48 h，重复操作3～5次，直到获得单菌株的纯培养物。将该菌株进行斜面划线培养，4 ℃保藏备用。

1.3.2 菌株生理生化鉴定

将样品原液用生理盐水10倍系列稀释成10-7～10-1个/mL样品稀释液，各取1 mL样品稀释液分别注入到灭菌的90 mm平皿内，分别将NA培养基、SDA培养基、MC培养基、MRS培养基、莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基(以下简称“改良MRS”)倾注到平皿内，每皿15 mL，摇匀，每个稀释度2个平行。NA培养基置于30 ℃培养箱中培养24～48 h，SDA培养基置于28 ℃培养箱中培养48～72 h，MC培养基置于36 ℃培养箱中培养48～72 h，MRS培养基和改良MRS培养基置于厌氧罐中，36 ℃培养箱中培养48～72 h。

根据各培养基上生长的菌落特征进行革兰氏染色镜检并计数，并根据镜检结果将菌落在培养基上进行分离纯化至3 代，应用全自动微生物鉴定仪对3 代纯菌种进行46种生化试验，充分对微生物进行菌属识别(ID)分析。

1.3.3 菌株分子生物学鉴定

提取分离菌株的基因组DNA，该菌株基因组DNA为模板，扩增其16S rDNA基因片段。PCR反应体系为：10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(各 2 mmol/L)2 μL，上游引物(25 μmol/L)1 μL，下游引物(25 μmol/L)1 μL，rTaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，

DNA模版 2 μL，补足重蒸水至终体积25 μL。

PCR反应条件：95 ℃ 3 min预变性，94 ℃ 45 s变性，33 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30个循环，72 ℃ 10 min延伸。引物序列上游引物F：5′-T￣T￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣G￣G￣C-3′，下游引物R：5′-A￣G￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣T￣A￣A￣T￣A￣C￣T￣C￣C￣T￣A￣C-3′。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离纯化

用LBS 培养基从淘米水发酵液中共分离纯化得到5株具有乳酸菌典型特点的菌株，其中3株菌株为革兰氏阳性菌，可作为嗜酸乳杆菌疑似菌株，编号为1-3，3株乳杆菌疑似菌株菌落形态见表1，菌株放大1000倍后显微形态见图1。

表1 菌株菌落形态及革兰氏染色结果

图1 菌株显微形态(1 000倍放大)Fig.1 Microscopic morphology of three bacterial strains(×1 000)

2.2 菌株生理生化鉴定

通过对3株嗜酸乳杆菌疑似菌株进行46项生理生化试验，结果见表2。

由表2可初步确定3号菌株与嗜酸乳杆菌的生理生化指标相近，其鉴定可信度达到90%。

表2 3号菌株46种生理生化鉴定结果

2.3 菌株分子生物学鉴定

细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列[12-13]。在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定[14-15]。

将3号菌株进行16S rDNA测序，其序列如下。

5′-T￣G￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣A￣G￣C￣C￣G￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣T￣G￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣C￣A￣A￣A￣T￣A￣A￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣C￣T￣A￣C￣C￣T￣C￣T￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣C￣A￣A￣C￣A￣G￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣T￣C￣C￣G￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣G￣G￣C￣G￣T￣T￣G￣C￣T￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣G￣A￣C￣T￣T￣G￣C￣G￣T￣C￣C￣A￣T￣T￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣A￣T￣T￣C￣C￣C￣T￣A￣C￣T￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣C￣C￣C-3′。

将测序结果用 BLAST进行序列比对，结果表明该菌株与GenBank中发表的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)同源性为 99%。可见3号菌株与嗜酸乳杆菌同源性较强，鉴定该菌株为嗜酸乳杆菌，命名为CFC-001。

嗜酸乳杆菌具有多种益生功效，包括调节肠道菌群失调，通过杀菌和竞争附着位点的作用抑制病原菌的滋生和入侵，调节免疫力,延缓机体衰老等作用[16]。

目前桂林市黄洛瑶寨地区人群在洗发过程中长期使用淘米水发酵液，不使用任何洗发水和护发素，该地区发质和头发根部头皮质量都要优于其他地区。经过本实验筛选后发现该淘米水发酵液中嗜酸乳杆菌的菌落总数达到3.8×107CFU/mL，是该体系中的优势菌群之一，所以认为嗜酸乳杆菌可以对头发和头皮的微生态产生积极的影响，可以有效养护头发与头皮，但是作用机制尚不明确，需进行进一步的研究。