黄芩苷诱导自噬改善胰岛素抵抗

郗有丽，周 杰，聂 超，葛卫红

(1.南京鼓楼医院 药学部，江苏 南京 210008； 2.江苏卫生健康职业学院 药学院，江苏 南京 211800)

由于不健康的生活方式，导致全球20～79岁成人糖尿病的患病率已达7.3%，估计到2045年将达到8.3%，其中2型糖尿病患者占90%以上，已成为全球十大死亡原因之一[1]。胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)又称胰岛素耐受，是指机体对胰岛素的敏感性降低，导致葡萄糖的摄取及利用减少，血糖升高，常伴有脂质代谢紊乱，是引发2型糖尿病的主要原因及病理基础[2]。

黄芩苷(结构式见图1)是黄芩的主要活性成分，作为一种黄酮类化学物，临床常用来治疗炎症、高血压、心血管疾病以及细菌和病毒感染等[3-4]。Xi等[5]研究发现在前期动物实验中黄芩苷能够改善胰岛素抵抗小鼠的血脂紊乱，降低高血糖和空腹血清胰岛素水平，从而改善糖耐量和胰岛素耐量异常，但是其具体作用机制尚不明。

自噬(autophagy)是指在真核细胞中由双层膜包裹部分胞质或者细胞器等形成自噬体，随即与内涵体融合成自噬内涵体，再与溶酶体形成自噬性溶酶体，最终降解所包裹内容物的过程[6]。自噬在糖尿病中也起着重要的作用，作为细胞的一种防御机制，自噬能清除胞质内受损的细胞器、有害的蛋白质等，从而保护细胞免受损害[7]。Yan等[8]研究发现，当机体出现胰岛素抵抗时，细胞自噬被抑制，而升高肥胖小鼠肝脏自噬水平后，胰岛素抵抗能得到明显改善[9]。

图1 黄芩苷的结构式Fig.1 The structure of baicalin

因此，本研究以BRL-3A 细胞(大鼠肝脏间质细胞)复制胰岛素抵抗细胞模型，给予黄芩苷进行干预，观察黄芩苷对胰岛素抵抗的作用，探究其作用机制。由于目前国内外未见有关黄芩苷通过增强自噬从而改善胰岛素抵抗的报道，故本研究以期为治疗胰岛素抵抗和开发理想的治疗药物提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞株

BRL-3A 细胞，购于中国科学院上海细胞中心。

1.2 药物与试剂

黄芩苷(纯度98%)，四川广汉市草本植化有限公司；棕榈酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 高糖培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，美国Gibco公司；葡萄糖和甘油三酯试剂盒，南京建成生物工程研究所；LC3-I、LC3-II和GAPDH抗体，美国Cell Signaling Technology公司；PVDF膜，美国Millipore公司；Trizol，美国Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒，美国 Thermo Fisher公司。

1.3 实验仪器

XD-101型CO2培养箱，日本 SANYO公司；H1650R型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；CX31型生物正置显微镜，日本OLYMPUS公司；Western SDS-Page型电泳仪，美国BIO RAD公司；MICROCHEMI化学发光成像仪，以色列DNR公司；普通梯度PCR仪，美国ABIVeriti 96 well Thermal cycler；荧光定量PCR仪，美国ABI stepone plus；UV-2450型紫外光度仪，日本SHIMADZU公司。

1.4 细胞培养方法

将BRL-3A 细胞用含胎牛血清FBS(10%，体积分数，下同)的DMEM 高糖培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO2(体积分数，下同)培养箱中培养，隔24 h更换含FBS的DMEM 高糖培养液继续培养传代。

1.5 葡萄糖消耗量的测定

按文献[10]的方法，将100 μL BRL-3A细胞悬浮液(1×105个/mL)接种于96 孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养24 h后，除空白组外，其余BRL-3A细胞均采用0.2 mmol/L棕榈酸(PA)处理24 h 后，给予黄芩苷进行干预。将所有细胞实验分成4组：1)空白组：BRL-3A细胞+含10%FBS的DMEM 高糖培养液；2)模型组：经PA处理的BRL-3A细胞+含10%FBS的DMEM 高糖培养液；3)黄芩苷高剂量组：经PA处理的BRL-3A细胞+0.1 mmol/L黄芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培养液；4)黄芩苷低剂量组：经PA处理的BRL-3A细胞+0.05 mmol/L黄芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培养液。将细胞共培养24 h后，收集上清液，采用葡萄糖试剂盒检测上清液中葡萄糖含量，并计算葡萄糖的消耗量。

1.6 甘油三酯含量的测定

将2 mL BRL-3A细胞悬浮液(1×105/mL)接种于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，细胞处理与分组方法同1.5节。细胞共培养24 h后收集细胞，进行超声破碎，采用甘油三酯试剂盒检测甘油三酯的含量。

1.7 Western blotting法检测自噬蛋白LC3-I、LC3-II和Beclin1的表达

将2 mL BRL-3A细胞悬浮液(1×105/mL)接种于6 孔板培养，细胞处理与分组方法同1.5节。细胞共培养24 h后弃上清，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4 ℃ 12 000 r/min，离心20 min，收集上清液，用BCA法测定总蛋白浓度，采用SDS-PAGE凝胶电泳，每孔加入30 μg 蛋白，转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%质量分数脱脂奶粉室温封闭1 h，置于LC3-I、LC3-II和Beclin1多克隆抗体(体积比为1∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤5次，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG二抗室温下孵育1 h，用TBST洗涤5次，化学发光成像系统发光成像。

1.8 RT-qPCR法检测自噬基因Beclin1的表达

将2 mL BRL-3A细胞悬浮液(1×105/mL)接种于6 孔板培养，细胞处理与分组方法同1.5节。Trizol试剂盒提取细胞总RNA，分光光度法测定RNA纯度。用cDNA反转录试剂盒将提取RNA进行反转录为cDNA。用荧光染色法和荧光定量PCR仪进行实时定量PCR。引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，引物设计序列为GAPDH primer (101 bp)[5- A￣C￣A￣A￣C￣T￣T￣T￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣G-3(Sense)和5-G￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣T￣T￣T￣C-3(Antisense)]；Beclin1 primer(140 bp)[5-A￣T￣G￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣A￣A￣A￣G￣T￣G￣C￣C￣A￣A-3(Sense)和5-G￣G￣G￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣T￣C￣T￣G-3(Antisense)]。扩增条件：95 ℃预变性5 min，随后95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃变性40 s，共40个循环。扩增产物特异性用溶解曲线监测，用软件计算各组目的基因相对表达量，以GAPDH为内参衡量靶细胞的目的基因表达量。

1.9 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 黄芩苷对BRL-3A细胞葡萄糖消耗量的影响

黄芩苷对BRL-3A细胞葡萄糖消耗量的影响见图2。由图2可知：经PA处理之后，BRL-3A细胞对葡萄糖消耗量均明显减少，表明发生了葡萄糖的摄取和利用障碍。其中，模型组细胞减少最为明显，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)。而黄芩苷高剂量组(0.1 mmol/L)和黄芩苷低剂量组(0.05 mmol/L)细胞对葡萄糖的消耗量明显增加，与模型组相比，具有显著性差异(P<0.01)。提示黄芩苷(0.05 mmol/L和0.1 mmol/L)可以增加BRL-3A细胞对葡萄糖的消耗量，改善细胞对葡萄糖的摄取和利用障碍。

与空白组相比，△△表示P<0.01；与模型组相比，**表示P<0.01图2 黄芩苷对BRL-3A细胞葡萄糖消耗量的影响Fig.2 Effects of baicalin on consumption of glucose in BRL-3A cells

2.2 黄芩苷对BRL-3A细胞甘油三酯含量的影响

黄芩苷对BRL-3A细胞甘油三酯含量的影响如图3所示。由图3可知：经PA处理之后，BRL-3A细胞甘油三酯含量均明显增多，引起细胞脂代谢紊乱。模型组细胞甘油三酯含量增加明显，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)。黄芩苷能够明显减少BRL-3A细胞中甘油三酯的含量(P<0.05、P<0.01)，且高剂量(0.1 mmol/L)效果强于低剂量(0.05 mmol/L)。提示黄芩苷可以减少BRL-3A细胞中甘油三酯的含量，改善细胞脂代谢紊乱。

与空白组相比，△△表示P<0.01；与模型组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05图3 黄芩苷对BRL-3A细胞甘油三酯含量的影响Fig.3 Effects of baicalin on triglyceridecontent in BRL-3A cells

2.3 黄芩苷对BRL-3A细胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1的影响

微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬产生的标志，有LC3-I型和LC3-II型。当机体出现缺氧、能量不足等应激状况时，细胞自噬被诱导，位于胞浆内的LC3-I就会转变成LC3-II，而LC3-II是位于自噬体膜上的，因此LC3-II的增多表明自噬体的生成增多，亦可用于衡量自噬的发生程度[11]。

Beclin1位于人类染色体17q21上，由BH3、中央螺旋区和进化保守区组成，是细胞自噬体形成过程中非常重要的自噬基因。Beclin1通过调节III型磷脂酰肌醇3-激酶的活性，促进自噬体膜的生成，与LC3-II的表达一致，是细胞自噬的正向调节因子，常常作为细胞自噬发生发展的评价指标[12]

结果显示：空白组BRL-3A细胞LC3-I多，LC3-II少，经过PA处理之后，模型组LC3-II更少，LC3-II/LC3-I的比值明显降低，Beclin1的表达也明显减少，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)，表明自噬被抑制。经黄芩苷干预之后，高剂量和低剂量组BRL-3A细胞LC3-I的表达减少，LC3-II的表达增多，LC3-II/LC3-I的比值明显升高，Beclin1的表达也明显增多(P<0.01)，表明自噬被诱导促进(图4)。

与空白组相比，△△表示P<0.01；与模型组相比，**表示P<0.01图4 黄芩苷对BRL-3A细胞自噬蛋白 LC3-II/LC3-I的影响Fig.4 Effects of baicalin on LC3-II/LC3-I in BRL-3A cells

2.4 黄芩苷对BRL-3A细胞自噬基因Beclin1的影响

进一步验证自噬基因Beclin1的表达情况，结果发现模型组BRL-3A细胞的Beclin1 mRNA的表达明显降低，与空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)。黄芩苷高剂量和低剂量组BRL-3A细胞的Beclin1 mRNA的表达明显升高，与模型组相比，具有显著性差异(P<0.01)，实验结果与自噬蛋白Beclin1的表达一致。提示黄芩苷可以增加Beclin1的表达，诱导自噬的发生。

与空白组相比，△△表示P<0.01；与模型组相比，**表示P<0.01图5 黄芩苷对BRL-3A细胞自噬基因Beclin1的影响Fig.5 Effect of baicalin on Beclin1 in BRL-3A cells

3 结论

1)将BRL-3A细胞采用0.2 mmol/L棕榈酸处理后，细胞对葡萄糖的消耗量减少，细胞中甘油三酯含量增多，表明BRL-3A细胞发生了葡萄糖的摄取和利用障碍，并出现脂代谢紊乱，证明胰岛素抵抗模型复制成功。同时发现经棕榈酸处理过的BRL-3A细胞LC3-II/LC3-I和Beclin1的表达降低，表明当BRL-3A细胞出现胰岛素抵抗时，自噬被抑制。

2)黄芩苷可以增加BRL-3A细胞对葡萄糖的摄取和利用，减少细胞中的甘油三酯含量，改善脂代谢紊乱状态及改善胰岛素抵抗，这可能与其促进自噬的发生有关。