人乳脂中甘油三酯分析方法及组成的研究进展

韦 伟，张星河，金青哲，王兴国(江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

母乳是一种天然的功能性食品，母乳的营养十分丰富，为新生儿提供生命中前几个月所需的全部营养物质，并且根据婴儿的生长发育不断地调整。母乳的组成复杂，目前研究者们发现母乳含有2 000多种物质，其中300多种是婴儿生长发育必不可少的成分。母乳中的脂肪，也称为人乳脂(HMF)，占母乳总量的3%～5%，是母乳中一种重要的组成成分。人乳脂是母乳中主要的能量来源，为婴儿提供了约一半的能量，同时富含具有特殊生理功能的脂肪酸和复杂脂类，也是脂溶性维生素的载体。

甘油三酯(TAG)是人乳脂中含量最多的一类脂质，约占98%。由于甘油三酯含有较多的同分异构体，各种同分异构体之间结构类似、性质相近，对其定性、定量分析都有一定的难度。人乳脂中脂肪酸组成非常复杂，因此甘油三酯同分异构体更多，而且大多数组成含量不到1%，分离分析的难度高。以往的乳脂肪甘油三酯的分析方法多是通过总脂肪酸组成和sn-2位脂肪酸组成计算得到。近年来，基于新型的分离技术如超临界流体色谱、检测技术如多维质谱技术等的迅速应用，加速了人们对甘油三酯立体结构的认识。

研究人乳脂甘油三酯组成的目的在于了解其生理功能和应用于人乳替代脂的开发。人乳脂中甘油三酯组成的分析为适合于我国婴幼儿的配方奶粉用油的研究奠定了基础。甘油三酯的分析还可用于建立基于甘油三酯的油脂识别模型。本文结合本实验室近期的研究工作和国内外相关研究进展进行综述。

1 人乳脂中甘油三酯的分析方法

1.1 人乳脂中甘油三酯的提取

人乳脂含有98%～99%的甘油三酯，0.26%～0.80%的磷脂，0.25%～0.34%的固醇(主要是胆固醇)，微量的甘油一酯、甘油二酯、游离脂肪酸和其他脂类成分。人乳脂中的甘油三酯的分析需要首先提取甘油三酯。目前最高效简便的方法是薄层色谱法(TLC)。通过TLC技术，采用硅胶G作为吸附剂，正己烷、乙醚和乙酸(或者甲酸)作为流动相可以实现甘油三酯的提取。

1.2 人乳脂中甘油三酯的分离

非水反相高效液相色谱(RP-HPLC)是测定人乳脂中甘油三酯最常用的液相方法。甘油三酯是弱极性化合物，难溶于水，有机溶剂可增加甘油三酯的溶解性，广泛使用的有机溶剂的组合是丙酮和乙腈[1]。固定相最常用的是十八烷基键合的硅胶柱(C18或ODS)。RP-HPLC分析甘油三酯的出峰按照碳原子当量数的大小依次洗脱。

银离子高效液相色谱是分离人乳脂中甘油三酯同分异构体的最有效的色谱方法[2]。甘油三酯根据其组成脂肪酸的不饱和程度不同而得到分离，甘油三酯分子中双键数量越多，保留时间越长。甘油三酯分离先后顺序是：SSS、SSM、SMM、SSD、MMM、SMD、MMD、SDD、SST、MDD、SMT、MMT、DDD、SDT、MDT、DDT、STT、MTT、DTT、TTT，其中S、M、D、T分别为饱和、单不饱和、含有两个及三个双键的脂肪酸。分离甘油三酯同分异构体的出峰先后顺序为[1]：SMS、SSM、SMM、MSM、SDS、SSD、DSD、DDS、DMD、DDM。

高温气相色谱法分析甘油三酯稳定性高、准确性好,但只适用于脂肪酸饱和度较高的样品[3]，不饱和度较高的甘油三酯可能会在高温下氧化裂解[4]。甘油三酯的出峰顺序按照其碳总数(CN)从小到大出峰[1]。目前主要采用非极性和中等极性两种填料，前者能得到不同CN的甘油三酯，而后者可以具体到单个甘油三酯的种类。一种常用的WCOT柱(材料为熔融石英，具有甲基苯基硅氧烷聚合物的涂层，25 m×0.25 mm)分离甘油三酯的出峰先后顺序为：SSS、SSM、SSD、MMM、SDM、MMD、SDD、MDD、DDD、DDT。

超临界流体色谱(SFC)是气相色谱和高效液相色谱的重要补充技术，流动相是液化气体(通常是CO2)[5]。SFC使用与GC类似的色谱柱，如果添加改性剂可以实现更好的分辨率，将甘油三酯同分异构体进行分离和鉴定。甘油三酯的出峰先后顺序为：SMD、MMM、SDD、MMD、MMT、MDD、DDD、MDT、MTT、DDT、DTT[6]。

1.3 人乳脂中甘油三酯的测定

蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型的质量检测器。ELSD可以用有机溶剂进行梯度洗脱，因为有机溶剂蒸发，所以对于非水相、挥发性高的有机溶剂测定结果没有基线漂移带来的误差。ELSD对于甘油三酯的灵敏度显著高于紫外检测器和折光检测器，是目前测定人乳脂中甘油三酯最常用的检测器。

质谱(MS)不仅具有常见检测器的检测功能，还同时具备化学结构解析功能，可以在无标准品的条件下，利用特征碎片离子即可进行分子结构分析。MS与其他色谱技术的联用(如GC-MS，HPLC-MS)，大大提高了甘油三酯分析的灵敏度和准确度，为甘油三酯的分析提供了强大的技术支撑。目前，适用于甘油三酯分析的MS电离源主要有电喷雾源(ESI)、大气压化学电离源(APCI)、大气压光电离源(APPI)等。

ESI理论上并非最适用于甘油三酯分析,但由于甘油三酯的手性结构，sn-2位的脂肪酸较sn-1,3 位更难断裂，因此可用于确定甘油三酯的结构[7-8]。APCI是分析甘油三酯的一种较为理想的技术手段[9]。APCI谱图上，甘油三酯主要形成3种特征碎片离子：[M+H-RCOOH]+、[M+H-RCOO-R’CO]+和[RCO]+，可根据其[DAG]+碎片及丰度判断TAG组成及脂肪酸的酰基位置[10]。APPI与APCI相似，适用于甘油三酯的分析。但APPI质谱图中甘油三酯共有4种特征离子，即：[M+H]+、[M]+、[RCO]+和[RCO-H2O]+。其中较为特别的是[RCO-H2O]+，该离子碎片不会出现在甘油三酯相应的ESI质谱图中，但这个信息对于甘油三酯鉴定却十分有用[11]。

常用的其他质谱仪还有四极杆飞行时间质谱(Q-TOF/MS),可在宽质量范围内实现高分辨、得到物质准确相对分子质量、能够获得真实的同位素峰形成分布，同时具有高灵敏度的串联质谱功能[12]。该技术得到未知物的分子式，既可用于甘油三酯的定性与定量，也可用于脂质组学的研究。串联质谱(MS/MS)可以有效地解决软离子化技术(如ESI、MALDI等)造成的碎片离子信息不够的问题，解决问题的方法是在这些软离子碎片的基础上串联另外一个质谱[13]。串联质谱能实现母离子和子离子的精确质量测定，是目前鉴定甘油三酯及同分异构体最有效的方法之一。

2 人乳脂中的甘油三酯组成

2.1 不同国家及地区人乳脂中甘油三酯的组成

Breckenridge等[14]采用GC配备氢火焰离子化检测器(FID)测定人乳脂中甘油三酯组成。结果显示，加拿大人乳脂中主要的甘油三酯类型为C52(39.0%)、C50(17.6%)、C54(16.4%)、C48(9.0%)和C46(5.5%)，甘油三酯酰基碳原子数最高为C60，最小为C38。采用GC测定的人乳脂中甘油三酯主要为C52(约占40%)，但是其中具体的结构和含量不得而知。通常结合脂肪酸和甘油三酯碳骨架sn-2位脂肪酸含量，大致猜测甘油三酯的结构[15-16]。目前两者结合的方法在结构甘油三酯(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯等)合成上经常被使用[17]，主要是由于设备要求低，方法简便，但是不能测定甘油三酯的具体结构和含量。

Morera等[18]利用HPLC-ELSD分析了西班牙47个不同哺乳时期的母乳中甘油三酯组成，共分离出30种甘油三酯[19]。结果显示有些甘油三酯的含量范围比较广(OPO含量17.56%～42.44%，OPL含量9.24%～38.15%)，另外有一些甘油三酯(LaMO、CaPO、LaCaO、LaPCa、LaOL等)的含量受到不同因素的影响较小，可以考虑作为人乳脂的指纹识别。随后又利用HPLC-ELSD测定了西班牙40个母乳成熟乳中的甘油三酯，并分析其组成与不同因素间的联系。Zou等[20]在45个丹麦母乳中分离并鉴定22种甘油三酯，其中含量较高的甘油三酯是OPO(21.52%)、OPL(16.93%)、OPLa+MMO(10.39%)、PPL(7.15%)和MLaO+POCa(6.65%)。夏袁[21]测定了我国无锡309个母亲在不同哺乳时期(每个时期103个样品)的人乳脂甘油三酯组成，分离并鉴定出25种甘油三酯。结果表明，含量最高的甘油三酯为OPL(23.24%～28.34%)，其次是OPO(13.87%～19.47%)，除此之外，含量相对较高、平均含量大于5%的甘油三酯为OLL、PLL、MOL、POLa、PPO。

Haddad等[22]采用RP-HPLC配备二极管阵列检测器和GC测定了8名意大利志愿者母亲的成熟乳的甘油三酯，并用RP-HPLC串联ESI-MS3对甘油三酯进行了鉴定。共鉴定出98种甘油三酯分子，其中含量较高的是OPO(13.587%)、PPO/MSO(9.790%)、LaPO/MMO/MPPo(8.078%)、MOO/PPL/MSL/PpoO(7.449%)、PLL/PoOL/POLn(7.067%)。Kim等[23]测定了美国母乳中甘油三酯的组成，利用高离析液相色谱法对甘油三酯进行分离，利用ESI-MS 对甘油三酯进行鉴定。结果显示，含量最高的甘油三酯是PPO(11.00 mg/L)、OPL(10.14 mg/L)、OPO(9.87 mg/L)、SPL(9.87 mg/L)和SPO(6.66 mg/L)，共测定出21种甘油三酯。Ten-Doménech等[24]利用RP-HPLC 配备UV和ELSD两种检测器测定15个来自西班牙的不同哺乳时期的人乳脂甘油三酯，共鉴定出42种甘油三酯，两种方法测定出的高含量的甘油三酯分别是OPO(20.3%、20.21%)、OPL(9.88%、10.1%)、LaPO/MMO(7.39%、7.30%)。

Tu等[25]采用SFC串联Q-TOF-MS测定了我国54个不同区域(北京、湖北和四川)、不同泌乳时期的人乳脂中甘油三酯的组成，共分离鉴定64种甘油三酯。结果显示，不同地区和泌乳时期的人乳脂中含量最高的甘油三酯都是OPL(10.09%～5.84%)，其次分别是OPP、OLO、SOL、OLL、SPO、OMM、OLL和OPLa。

Kallio等[26]采用UPLC-MS和UPLC-MS/MS测定了芬兰和我国人乳脂中甘油三酯的组成，共鉴定300多种甘油三酯同分异构体。同时发现在芬兰人乳脂中含量较高的甘油三酯分别是OPO(9.4%)、OPL(5.4%)、OPLa(3.5%)、OPS(3.2%)、OMO(3.2%)、OPP(3.0%)、OLaO(2.5%)和OOO(2.5%)。而我国人乳脂中含量较高的甘油三酯分别是OPL(10.3%)、OPO(7.1%)、LPL(4.5%)、LLO(3.3%)、OPS(2.4%)、LOO(2.4%)、OPP(2.4%)、LlaO(2.2%)和OPLa(2.1%)。同分异构体差异超过2%的甘油三酯在芬兰人乳和我国人乳中分别占32.7%和36.7%。

2.2 不同泌乳时期母亲的人乳脂中甘油三酯组成

研究表明人乳在分泌过程中会随着婴儿的生长发育的需要而发生改变，通常将婴儿出生后1～5 d(或7 d)的母乳称为初乳，出生后6～15 d的母乳称为过渡乳，出生16 d及之后的母乳称为成熟乳。

夏袁[21]发现我国无锡地区309个人乳脂样品中，3个哺乳时期的人乳脂中甘油三酯组成有一定的区别，含量最高的甘油三酯为OPL，3个哺乳时期分别是28.34%、23.24%、24.92%，仅次于OPL的是OPO，含量分别是19.47%、14.05%、13.87%。Morera等[19]测定了不同哺乳时期的人乳脂中甘油三酯，发现每个哺乳时期人乳脂中甘油三酯呈现特定的组成，几种甘油三酯在不同泌乳时期的人乳脂中显著不同，含量最高的甘油三酯是OPO和OPL，在初乳、过渡乳和成熟乳中分别占到29.07%、20.11%，19.23%、14.97%和23.73%、18.8%。Tu等[25]发现，不同泌乳时期的人乳脂中甘油三酯组成有一定的区别，并且都与婴儿配方奶粉中的甘油三酯组成有显著的区别。

上述研究表明，3个哺乳时期的人乳脂不仅营养成分含量区别较大，构成也显著不同，但是目前观察到的变化没有统一的规律。未来应该对不同哺乳期人乳脂中甘油三酯的变化规律及机制进行研究，用以指导不同阶段婴幼儿配方奶粉的生产。

2.3 母亲饮食对人乳脂中甘油三酯组成的影响

近年来研究表明，人乳脂中甘油三酯组成的差异主要受母亲饮食的影响。Linderborg等[27]用两种方法(阴离子APCI-MS/MS和阳离子UPLC/ESI-MS/MS)分析了芬兰西南部的不同饮食和体质指数母亲的人乳脂中甘油三酯组成。结果显示，母亲的体重和饮食会影响甘油三酯的分布，但对甘油三酯的位置特异性的影响是相同的。食用推荐饮食的正常体重母亲的人乳脂中含有更高含量的亚麻酸(Ln)和较少含量的硬脂酸(S)。无论是哪种人乳脂，其中含量最高的甘油三酯是OPO(约14.6%)。

夏袁[21]也发现我国无锡地区的志愿者母亲的人乳脂中甘油三酯含量最高的是OPL，通过膳食调查与人乳脂组成比较发现饮食对于人乳中甘油三酯的组成有影响，不同于普遍报道中含量最高的OPO，无锡地区的母亲可能因为食用较多的海产品(富含亚油酸)而在人乳中有较高的OPL。

3 结束语

甘油三酯是人乳脂中含量最高的脂质。通过对人乳脂中甘油三酯组成的总结，可以得到以下结论：①不考虑光学异构体，人乳脂中含有至少三四百种甘油三酯；②不同地区的人乳脂中甘油三酯有一定的差异，普遍报道中含量最高的甘油三酯是OPO，我国母亲的人乳脂中含量较高的是OPL；③人乳脂中甘油三酯组成受到母亲饮食的影响，不同哺乳时期的人乳脂中甘油三酯组成不同。

未来的研究方向包括如下几个方面：①多维色谱技术和多维质谱技术。多维色谱可以对同分异构体达到很好的分离，但是受到流动相的影响，目前多维色谱应用在甘油三酯的研究多为离线二维色谱，开发新型的仪器设备或者色谱柱填充材料是研究方向之一。基于质谱技术的脂质组学方法，尤其是多维质谱技术可以有效地鉴定更多甘油三酯的结构。②人乳脂中甘油三酯组成的大数据分析。搜集不同国家、地区、民族、饮食等的母亲的母乳，分析其中甘油三酯的组成，研究不同国家、地区、民族等因素与人乳脂中甘油三酯的联系，考察饮食、哺乳时期、身体状况等因素对人乳脂中甘油三酯的影响，建立基于甘油三酯的指纹信息识别图谱。③开发适合于我国宝宝的婴幼儿配方奶粉用油。根据我国人乳脂的数据，开发适合我国宝宝“个性化”的营养需求的婴幼儿配方奶粉用油也是未来的研究重点。

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