原核表达家蝇抗菌肽Phormicin A,B蛋白对大肠杆菌标准株的影响

2019-12-30王代琴韦鹏威吴建伟

生物加工过程 2019年6期

王兵,杜兵,王代琴,覃海,韦鹏威,姚杨,万珊,王涛,吴建伟

(1.贵州医科大学生物与工程学院生物技术教研室，贵州贵阳 550025；2.贵州医科大学医药生物技术工程研究中心，贵州贵阳 550025；3.贵州医科大学第一附属医院微生物免疫科，贵州贵阳 550025；4.贵州医科大学基础医学院微生物学教研室，贵州贵阳 550025；5.贵州医科大学基础医学院病原生物学教研室，贵州贵阳 550025)

超级耐药菌的出现，使人们愈发意识到病原菌抗生素耐药问题的严重性，传统抗生素现已不能满足耐药病原菌临床治疗的需求[1-4]。抗菌肽是近年来新兴的新型抗菌剂，关于其对病原菌的研究也有诸多报道[5-7]。Li等[8]发现眼镜王蛇蛇毒抗菌肽OH-CATH30对临床耐药铜绿假单胞菌引起的角膜炎具有很好的治疗效果。Wei等[9]发现了一种既具有强抗菌能力又可抑制炎症反应的新型抗菌肽Cathelicidin-P Y。 Chromek等[10]发现cathelicidin型抗菌肽LL37可以保护尿路防止被大肠杆菌侵入感染。抗菌肽由于可进行多靶点作用，不易产生耐药性，因而已成为新型抗菌剂药物候选者和研究的热点[7,11-12]。

家蝇(housefly,Muscadomestica)又名苍蝇，能够在脏而复杂的环境中生存，很大程度上是依赖其强大的免疫系统[13-15]。而抗菌肽则是其免疫系统中非常重要的一类物质，在其天然免疫系统中发挥着重要的作用。防御素则是抗菌肽中被研究的较多的一种[12,16]。Phormicin 是早在1989年于绿蝇(Phormiaterranovae)中被首先发现的，被称为绿蝇防御素的抗菌肽，同时还发现了2个成员Phormicin A、B，但二者只相差一个氨基酸，且只对革兰氏阳性菌有抑制效果[17-18]。大肠杆菌是在临床造成尿路感染的一种常见菌[10]。

笔者及所在课题组已经克隆了家蝇防御素家族Phormicin A、B基因，将去掉信号肽的部分分别构建于原核表达载体pET28a上，之后采用原核表达法获得了二者蛋白。本研究以家蝇防御素家族PhormicinA、B抗菌肽为研究对象，探究其原核表达蛋白对大肠杆菌的作用效果，并绘制了时间抑菌曲线，以期为抗临床大肠杆菌抗感染药物的研发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

菌株E.coliDH5α克隆菌株、E.coliBL21(DE3)表达菌株，北京索莱宝有限公司；E.coli标准株(ATCC25922)，由贵州医科大学微生物教研室王涛老师提供；质粒pET-28a(+)，北京安诺伦生物科技有限公司；质粒pMD19-T，北京宝日医生物技术有限公司。

1.1.2 酶与主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶，美国NEB公司；质粒小抽试剂盒、DNA回收试剂盒，杭州AXYGEN爱思进生物技术有限公司；Ni-NTA His.Bind蛋白纯化试剂盒、其他相关耗材，德国Merck公司；Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白电泳试剂盒，北京索莱宝有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基因片段的扩增及质粒构建

以家蝇cDNA为模板，采用PCR法扩增，利用分子生物学方法，并将不含信号肽的部分片段插入到pET28a载体上构建原核表达质粒,所用引物有Phormicin A 28 F：C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣T￣G￣C￣C￣C￣C￣C￣A￣A￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣G; Phormicin A 28 R：C￣C￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣G￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣C; Phormicin B 28 F：C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣C￣G￣C￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣G￣C￣C￣A￣A￣C; Phormicin B 28 R：C￣C￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣A￣T￣A￣C￣A￣G￣C￣C￣C￣T￣G￣C。

1.2.2 目的蛋白的原核表达及检测

将构建好的原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆37 ℃摇菌并保种。将菌种接入无菌LB培养基中，放入37 ℃、200 r/min 恒温摇床培养2.5 h，酶标仪测OD600。当OD600介于0.3～0.5时，取出菌液并冷却到4 ℃后实验组加入诱导剂IPTG，使诱导剂的最终0.4～0.6 mmol/L。加好IPTG后，继续放入22 ℃、160 r/min恒温摇床继续培养6～12 h。弃上清后离心(本文中如无特殊说明，离心均采用12 000 r/min)收集菌体，高压均质仪破碎后PBS缓冲液重悬备用。根据实验需要，再次离心，分为上清和沉淀。若目的蛋白在沉淀中，则加入8 mol/L尿素促溶解后放入透析袋。梯度透析法对目的蛋白进行透析和重折叠[19-20]。将折叠后目的蛋白粗悬液用滤膜过滤除杂。通过Ni-NTA His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化制备目的蛋白。分别加入蛋白上样缓冲液后煮沸制备蛋白电泳样品。Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白电泳试剂盒制备小分子胶(16.5%分离胶，10%夹层胶，4%浓缩胶)后，上样、电泳，考马斯亮蓝染色，冰醋酸脱色后，检测目的蛋白表达及纯化情况。为进一步确定蛋白浓度，可用Nanodrop 2000设备和BCA试剂盒共同测定蛋白样品浓度。

1.2.3 微量液体稀释法测定抗菌肽原核表达蛋白的最小抑菌浓度(MIC)

提前1 d将大肠杆菌标准株划线于LB平板上，挑取单克隆菌体接种摇菌12 h左右。将摇好的菌液用生理盐水稀释至0.5的麦氏比浊浓度(约为1×108个/mL，以比浊卡和比浊管来配置和稀释。取1640RPMI无血清培养基或LB培养基100 uL于无菌96孔板中，按相应比例计算好的样品浓度，分别加入卡那、咪唑和目的蛋白悬液后，接入相应的菌种，总体积200 uL。37℃、120 r/min培养3～6 h或根据实验需要培养到相应的时间。酶标仪测定96孔板每孔的OD600值，并将96孔板拍照。根据孔板颜色变化，可以计算出其MIC值。为了进一步验证，避免误检，将相应孔的混合物吹打均匀后涂布平板，培养12～16 h后，进一步观察是否有菌生长及菌落生长密度。根据二者结果，综合测定其MIC值。

1.2.4 原核表达蛋白对大肠杆菌标准株时间生长曲线的绘制

从接种到加药和目的蛋白过程同上1.2.3。同时做多个平行组，到达相应时间点后，酶标仪测定0、1、2、3、4、5、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30 h的OD600值。最后，统一统计并分析数据作图。通过比较OD值的大小，绘制时间生长曲线，来分析目的蛋白对于大肠杆菌标准株生长的影响。

2 结果与讨论

2.1 家蝇防御素家族Phormicin A、B基因原核表达载体的构建

参照NCBI基因库中家蝇Phormicin A、B的序列信息(基因序列号为LOC101887709-8、LOC101888043-5)来设计引物，采用PCR法从家蝇cDNA中扩增目的片段，测得序列后，利用分子生物学方法将去掉信号肽的部分构建于原核表达载体pET28a上。将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，再次用引物筛克隆(图1)测序后并保存菌种。

M代表标准DNA,从上至下条带分别为2 000、1 000、750、500、250和100 bp；1、2、3、4泳道为PCR扩增的目的片段，约为270 bp;-代表阴性对照图1 PCR筛选单克隆菌种DNA电泳Fig.1 The DNA agrose map of Phormicin A and B prokaryotic expression monoclone bacteria seeds by PCR screen method

此外，对家蝇Phormicin A、B基因编码的氨基酸序列进行了比对分析，并采用N-J法构建了系统进化树(图2)。由图1和2可知：家蝇Phormicin 属于防御素家族，因翻译成中文是绿蝇肽，家蝇绿蝇肽，不太通顺，因此选用英文原称表述。最后构建了二者去掉信号肽之后蛋白对应序列的原核表达载体，为下一步原核表达实验提供了基础。

图2 家蝇Phormicin A、B氨基酸序列比对及进化树Fig.2 The multisequence alignment map and phylogenetic tree of housefly Phormicin A and B

2.2 家蝇Phormicin A、B蛋白的原核表达及亲和纯化

采用IPTG诱导法，表达并纯化了家蝇Phormicin A、B的原核表达蛋白。然后通过Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白电泳，检测目的蛋白的表达情况。由图3可知：家蝇Phormicin A蛋白在上清和沉淀中都有表达，而B蛋白则在上清中表达稍多，沉淀中也有少量表达。二者在去掉信号肽后剩余70和69个氨基酸，但构建到原核表达载体pET28a中时，在片段的N段和C端都带上了His标签，还有载体上部分表达的氨基酸，综合来说约有90个氨基酸，因此根据估算，蛋白大小约为(9～10)×103。IPTG小规模诱导后进行小分子蛋白电泳实验。由图3还可知：成功诱导了家蝇Phormicin A、B蛋白的原核表达。另外，在构建表达载体时用的是大肠杆菌DH5α克隆菌株，原核表达用的是大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，还有后面实验用的大肠杆菌标准株，三者为大肠杆菌不同的株系，因为发挥作用及用途不同而分别命名。此3株大肠杆菌为分子生物学实验中比较常用的菌株。

C代表control 未诱导对照组；S代表上清样品；P代表沉淀样品；M代表Mark图3 Tricine-SDS-PAGE检测 Phormicin A、B原核表达蛋白Fig.3 The Tricine-SDS-PAGE map of prokaryotic expression Phormicin A and B protein

在成功进行二者目的蛋白的原核表达后，采用Ni-NTA His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化制备目的蛋白。大规模诱导后，发现家蝇Phormicin A、B蛋白在沉淀中远远多于在上清中的表达，这可能暗示着其对宿主大肠杆菌的生长可能有影响，而大部分都以包涵体的形式被包裹起来。于是采用尿素溶解，透析袋梯度透析复性法，制备二者的蛋白悬液[19-21]。

接下来采用Ni-NTA His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化制备目的蛋白。在纯化上柱子前，先用过滤器将杂质进行初步排除，否则亲和纯化柱容易被堵。纯化的基本原理是通过活化的亲和树脂柱将带有His标签的目的蛋白吸附到树脂上，然后用洗脱缓冲液进行冲洗，将非特异结合的多余杂蛋白洗脱下来。最后用合适浓度和体积的咪唑将目的蛋白洗脱下来，收集起来。因为His组蛋白含有咪唑基团，咪唑洗脱时，是与树脂发生亲和置换反应，此方法也是在蛋白表达纯化中，用的较多的一种。除此之前，还有谷胱甘肽疏基转移酶GST标签，麦芽糖蛋白标签等的标签和蛋白纯化方法。但是，GST标签等大概约27×103相对较大，如果要做后续的活性功能实验，还需要用特定的酶将标签切除，然后通过超滤离心等方法再收集目的蛋白。这样目的蛋白相对损失较多，得率不高，程序复杂一些，成本相对高一些，但大部分都是可溶性表达，有利于活性检测。如果不切除标签，可能对目的蛋白活性有干扰，而Phormicin A、B蛋白相对又较小，因此，综合考虑用His标签，用Ni-NTA His.Bind法纯化目的蛋白。

2.3 家蝇Phormicin A、B原核表达蛋白作用于大肠杆菌标准株的活性分析

在制得目的蛋白悬液后，采用微量液体稀释法，来检测目的蛋白对大肠杆菌标准株生长的影响。由图4可知：家蝇Phormicin A、B对大肠杆菌的生长具有一定的抑制效果。图4(a)是微量液体稀释法测得的结果，由图4(a)可知：前面4～5孔相对清澈，表明菌体生长较少或者不长菌，到最后4～5孔发现相对浑浊，表明已经长了很多菌。从第1～10孔是按照表1表格中的浓度依次倍比稀释过来，浓度逐渐降低。为了更进一步测量，又用酶标仪测量了每个孔OD600，图4(b)。由图4和表1可知：从第6孔往后，OD明显增大，表明菌体明显增多。而前面1～5孔则OD相对较小，说明加的药物组相对自然生长组是抑菌活性，但是由于是在3 h左右就测了，OD过小，不能够很好的说明问题，存在一定的误差。于是，又将一些孔通过平板涂布法，进一步确定具有抑菌效果最低浓度孔。卡那为第7孔,最小抑菌浓度(MIC)是4 mmol/L；咪唑为第6孔，MIC为15.63 mmol/L； A蛋白是第3孔，MIC为20 mmol/L；B蛋白是第4孔，MIC为7.5 mmol/L。由于Phormicin A、B原核表达蛋白是用咪唑洗脱下来的，是蛋白与咪唑的混合物，从分析表格中浓度发现：A、B蛋白中咪唑浓度12.5和6.25 mmol/L要小于咪唑本身的最小抑菌浓度15.63 mmol/L。

图4 Phormicin A、B、咪唑、Kna+对大肠杆菌影响的MIC检测Fig.4 Inhibition activity analysis of Phormicin A and B,imidazole,Kna+ to E. coli by MIC method

样品ρ(孔)/(mmol·L-1)12345678910Kna25612864321684210.5咪唑50025012562.531.2515.637.813.911.950.98A蛋白8040201052.51.250.6250.3120.156含有咪唑502512.56.253.1251.5630.7810.3910.1950.098B蛋白6030157.53.751.8750.9380.4690.2340.117含有咪唑502512.56.253.1251.5630.7810.3910.1950.098

2.4 家蝇Phormicin A、B蛋白作用大肠杆菌标准株的时间生长曲线

为了更进一步追踪家蝇Phormicin A、B蛋白对大肠杆菌标准株的影响，同时为了观察在不同时间段内，二者对于大肠杆菌标准株生长变化的作用，选取从第1 h，直到第30 h，用酶标仪测定OD600表征大肠杆菌标准株的浓度。由图5和6可知：在前3～4 h内，药物组OD偏小，随着时间的推移，OD逐渐增大，差异也更明显。根据测得的结果绘制了大肠杆菌的时间生长曲线，其中黑色方形代表自然生长对照组，红色代表卡那阳性对照组，蓝色代表咪唑组，绿色代表A蛋白组，紫色代表B蛋白组。2 MIC代表杀菌浓度即MBC是最小抑菌浓度的2倍，最初基本不长菌，或者只长很少的菌。1 MIC即最小抑菌浓度，0.5 MIC则是最小抑菌浓度的一半，抑菌效果更差一些。

图5 家蝇Phormicin A、咪唑、Kna+对大肠杆菌标准株的时间生长曲线Fig.5 The time growth curve of the standard E. colistrain affect by housefly Phormicin A,imidazole and Kna+

由图5可知：A蛋白2倍，1倍，0.5倍MIC相对其他对照组(natural group)，都具有一定的抑菌效果，在10～12 h期间更为明显，且随着浓度的减小，抑菌效果减小。由图6可知：B蛋白也是如此。但相对而言，B蛋白抑菌效果要稍好于A蛋白。综合分析，虽然二者都具有一定的抑菌效果，但距离临床应用其效果仍然不够理想。目前研究报道的抗菌肽多为体外合成，受合成条件和技术的限制，合成的多为40个氨基酸以内的小分子，最多不超过100个氨基酸，而且合成的多肽往往只具有简单的一级和二级结构，无法获得更高级的三级或四级结构。因此，合成的抗菌肽可能与昆虫等生物体内本来的构象差别较大，很多难以达到理想的效果。根据抗菌肽研究的相关报道[22]，目前想要获得功能活性较好的抗菌肽，往往构建基因工程载体，找到合适的表达条件，尝试采用更好的表达方法，实现可溶性表达，直接纯化出来，可能具有更为理想的作用效果，这也是抗菌肽研究的一个难点。而采用原核表达方法，虽然可以获得较大量的蛋白，但很多抗菌肽作为包涵体往往在沉淀中。可能一定程度上也影响了其功能，不能够达到体内构象所具有的效果。如果从天然样本中直接分离纯化，则需要的样本量又较大。采用昆虫细胞或者酵母等表达系统，获得的蛋白量又相对较少，成本相对较高。总体说来，找到一种合适的表达或生产抗菌肽的方法，对于精确研究其功能具有重要的意义，也是后续进行相关研究进一步努力的方向。