大鼠BMSC 与ADSC 体外Transwell 共培养诱导成骨的实验研究

金鑫 张志亮 陆毅 黄一雄 范志宏 陈蕊

各种原因造成的大面积骨缺损及难治性骨损伤的修复是临床的一大难题。目前常见的治疗方法都有各自的局限性，而再生医学和组织工程技术的发展为修复骨缺损提供了新的思路。

组织工程常用的成体干细胞有BMSCs 和ADSCs。BMSCs 成骨能力良好，是骨组织工程最佳的种子细胞来源。但因其取材困难、过程痛苦、细胞含量少等原因限制了其更广泛的应用。ADSCs 来源广泛、细胞量多、易获取、培养简单且扩增能力强等[1]，成为骨组织工程种子细胞的研究热点。但相比于BMSCs，其成骨能力不足[2]。因此，利用ADSCs 的既有优势，提高其成骨能力是亟待研究和解决的问题。

本研究将SD 大鼠的ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培养，观察BMSCs 对ADSCs 成骨分化的影响，探讨提高ADSCs 成骨活性的可能途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂及仪器

实验中ADSCs 及BMSCs 取自6 周龄雄性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）。

胎牛血清、DMEM培养基、Penicillin-Streptomycin、Osteocyte Differentiation Basal Medium（Gibco，美国），L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁盐AA2P、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、茜素红、胶原酶（Sigma，美国），氯化十六烷基吡啶（上海德茂化工有限公司）。

光学显微镜、倒置显微镜（奥林巴斯，日本），Infinite M2000 PRO 酶标仪（Tecan，瑞士），细胞培养箱（ThermaoFisher Scientific，美国）。

1.2 ADSCs 及BMSCs 的分离及培养

6 周龄雄性SD 大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下75%乙醇浸泡1 min 后取出附睾脂肪垫，将脂肪组织尽量剪碎，放入含有等体积、预热PBS 缓冲液的15 mL 离心管中，震荡45 sec，静置分层，吸除下层液体。重复上述两步骤，直至下层变澄清。加入胶原酶溶液，37 ℃水浴震荡，直至组织悬液混匀（50 min）。涡旋15 sec，彻底混匀细胞，离心（1 200 r/min，5 min）后小心吸除上清液，加入完全培养基后置于37 ℃、5%CO2培养箱中。24 h 后换液，去除未贴壁ADSCs细胞，以后每3 天换液一次。

取大鼠股骨和胫骨置于无菌的培养皿上方，依次用3～5 mL PBS 和无血清培养基冲洗2～3 次后移入另一无菌培养皿中。显露骨髓腔后用1 mL 注射器吸取培养基，从股骨一端插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2～3 次。在15 mL 离心管中加入3 mL 培养基，再用吸管沿管壁缓缓加入骨髓悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入完全培养基，并轻轻吹散细胞10～20 次制成细胞悬液，接种到10 mm 培养皿中，放入CO2培养箱中。3 d 后换液，去除未贴壁BMSCs 细胞。以后每3 天换液一次。

7～10 d 后，待两种细胞生长至80%～90%时，0.25%胰酶消化传代，按1×104cells/cm2密度接种于新的培养瓶中。本实验使用第2 代BMSCs 及ADSCs（经三系分化诱导及流式细胞检测证实具有相应间充质干细胞特性）。

1.3 ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培养

1.3.1 实验分组

第一组：单纯ADSCs 组；第二组：共培养组（ADSCs:BMSCs=1:1），上室为BMSCs，下室为ADSCs；第三组：单纯BMSCs 组。

取第2 代ADSCs 及BMSCs 进行共培养实验。0.25%胰酶消化，离心后细胞计数。重悬两种细胞至密度为1×105cells/mL。各组细胞按照分组比例加入Transwell 皿中，第一组1 mL 单纯ADSCs 悬液；第二组1 mL ADSCs+1 mL BMSCs；第三组1 mL 单纯BMSCs 悬液。各孔加入完全细胞培养基。24 h 后更换成骨诱导液。每隔3～4 天换液1 次，21 d 后进行相关染色及检测。

1.3.2 茜素红染色及半定量检测

PBS 清洗细胞表面2 遍，10%甲醛固定1 h。用新鲜配制的40 mM（pH 4.2）的茜素红染液室温孵育10 min，dH2O 清洗5 遍，PBS 孵育15 min，晾干，光镜下观察并拍照。

茜素红染色后，PBS 洗3 遍。弃上清，加入氯化十六烷基吡啶置于室温下30 min。吸取上清，置入96 孔板，每孔100 μL。使用酶标仪，波长562 nm 处测样本吸光值A。用氯化十六烷基溶液调零，并同时测定一组未加诱导液的单纯细胞的茜素红染色吸光值A。每个样本重复3 次，计算平均值及标准差。其中，样本测定值A=样本吸光值A-单纯细胞组吸光值A。将各组测得值以ADSCs 作为基准进行归一化。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两种细胞的分离培养及Transwell 共培养

原代ADSCs 在24 h 后贴附于培养皿表面，并开始沿培养皿底面伸展。培养至第2 代后，可见细胞与培养皿接触面积增大，由不规则状变为典型的长梭形。原代BMSCs 克隆样散在分布，以圆形贴壁细胞为主。传至第2 代，细胞形态均一，螺旋状生长。将两种第2 代细胞以Transwell 共培养，ADSCs 位于下层小室中，BMSCs 位于上层小室内。

2.2 茜素红定性及半定量染色

茜素红染色显示，ADSCs 与BMSCs 以Transwell共培养后出现了成骨效能的变化，茜素红染色阳性的钙盐沉积明显增多。茜素红半定量统计结果显示，共培养组结果与ADSCs 组相比，差别显著（P＜0.05），表明BMSCs 与ADSCs 共培养后能够通过旁分泌的方式产生相关生化信号，刺激ADSCs 的成骨分化。而共培养组与BMSCs 组相比无统计学差异，表明混合培养后的成骨效能与单纯BMSCs 组相当（图1）。

图2 各组茜素红染色及半定量检测Fig.2 Alizarin Staining and relative ARS level of each group

3 讨论

ADSCs 是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，由于其增殖能力强、取材容易、在体外培养中易定向分化为成骨细胞等优势，成为骨组织工程的种子细胞之一。Lendeckel 等[3]尝试使用自体ADSCs 来治疗1 例颅骨严重缺损的患者。动物实验证实，将ADSCs 植入小鼠颅骨缺损部位，12 周后能够完全形成骨化桥接。相较于其他来源干细胞，ADSCs 具有更强的增殖、成血管能力以及迁移和归巢的能力，但其成骨能力相较于BMSCs 还显不足[4]。以自体ADSCs 为种子细胞的颅骨修复的结果表明，由于其骨化不全等并发症，修复效果不能令人满意[5]。单纯用ADSCs 为种子细胞修复承重骨的研究更为少见。因此，提高ADSCs 的成骨效能是当前研究的热点。

目前，提高ADSCs 成骨分化能力的方法主要有外源性因子调控[6]、基因工程调控[7]和物理调控[8]。共培养即属于加入外源性因子的方法。共培养技术能够更好地模拟细胞在体内的生长环境和细胞的性状，利用一种辅助细胞去诱导目的细胞的分化、增殖及细胞活性的维持，进一步探究其中的机制。与体内研究相比，共培养系统体积小、参数可控、结果直观，更有利于研究细胞与细胞间，以及细胞与微环境间的相互作用。

Transwell 间接共培养，也叫分层渗透培养。主要用于研究细胞间的相互调节作用。两种细胞在同一培养皿中共培养，但由一层多孔膜相隔，使得两种细胞间只存在弥散因子的移动交换而没有直接接触。本实验中，ADSCs 与BMSCs 以Transwell 共培养，排除了BMSCs 对ADSCs 细胞直接接触的影响。茜素红及半定量染色结果表明，ADSCs 与BMSCs 共培养后，钙盐沉积量显著提高，成骨矿化能力增强。表明BMSCs 可通过旁分泌相关细胞因子来提高ADSCs 的成骨分化能力，为ADSCs 成骨分化提供良好的微环境。

间充质干细胞的成骨分化受到多种信号通路的调控。目前主要研究的MSCs 成骨相关信号通路包括TGF-β 信号通路、MAPK 通路、JNK 通路、PI-3K通路、Notch 通路、Wnt 信号通路等。间充质干细胞的成骨分化有许多信号通路参与，或许还存在没有发现的信号通路，大多数信号通路的确切机制并不明了，有关各通路之间相互联系的研究较少。因此，进一步研究信号通路任重道远。在Transwell 共培养体系中，BMSCs 旁分泌作用的细节仍未阐明，尚待进一步的实验研究。