不同麻醉药对树胶脂毒素处理后的不同种属小鼠存活率的影响

尹 翠 张奉明 朱 玲 毕凌波 顾佳慧 李 捷 张笑婷

江苏省麻醉学重点实验室，江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏 徐州 221004

良好的麻醉效果是实施动物实验的重要保证，决定着能否获得客观而真实的实验数据。目前国内医学、生物学实验研究中，小鼠麻醉经常使用水合氯醛和戊巴比妥钠，二者作用机制相近，都是小剂量镇静，中等剂量催眠，大剂量有麻醉与抗惊厥作用[1-4]。麻醉效果取决于多种因素，如动物品系、麻醉剂量等，如麻醉方法不当容易导致小鼠死亡[5-6]。树胶脂毒素(resiniferatoxin，RTX)是辣椒素(capsaicin，CAP)的高效能类似物，它是目前已知的最有效的瞬时受体电位通道香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)激动剂[7-10]。RTX引起的刺激使TRPV1激活离子通道通透性增加，阳离子(主要是钙离子)内流导致神经元去极化，这种刺激后可引起神经元脱敏从而产生镇痛作用[11-15]。本实验室经常使用RTX用于杀死成年小鼠的外周感觉神经纤维，但对于RTX处理不同种系小鼠的生存率以及戊巴比妥钠和水合氯醛对其病死率的影响尚无报道，本实验通过观察水合氯醛和戊巴比妥钠对树胶脂毒素处理后小鼠不同种属存活率的影响，可为科研工作者进行相关实验麻醉提供参考。

1 材料与方法

1．1主要试剂和设备1.0 mL注射器，戊巴比妥钠(生产批号：B17P0704V，北京普鲁顿生物科技公司)，水合氯醛(批号：20160715，国药集团)，树胶脂毒素(批号：APN14259-1-1，Abcam公司，美国)，阿托品(生产批号：1611251，天津金耀药业有限公司)，氨茶碱(生产批号：1702091，天津金耀药业有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(生产批号：B326BA3887，上海生工生物工程股份有限公司)，0.9% 氯化钠注射液，分析天平(上海精天电子仪器有限公司)。

1．2实验动物及分组清洁级健康成年C57BL/6小鼠24只，体质量24～28 g；Kunming种小鼠55只，体质量28～35 g，由徐州医科大学实验动物中心提供，饲养于空气过滤系统，自由进食饮水，昼夜节律，光照周期12 h，光照时间07：00～19：00。所有动物饲养和实验操作程序符合动物实验伦理委员会相关规定，并经徐州医科大学动物伦理会批准。采用随机数字表法分为4组：C57BL/6小鼠溶剂对照组(Ⅰ组，12只)、C57BL/6小鼠RTX组(Ⅱ组，12只)、Kunming小鼠溶剂对照组(Ⅲ组，10只)、Kunming小鼠RTX组(Ⅳ组，45只)。

1．3药物的配制RTX根据说明书加入溶剂DMSO配制成浓度为100 mM的存储液，实验中的RTX根据要求吸取所需剂量并用0.9%的氯化钠注射液稀释配制。水合氯醛和戊巴比妥钠分别用分析天平称量所需用量并用0.9%的氯化钠注射液稀释配成10%水合氯醛和2%戊巴比妥钠溶液。

1．4实验方法按前述分组，根据ENGEL 等[16]描述的方法，4组小鼠连续3 d皮下注射RTX或溶剂，2次/d，第1、2和3天的单次给药剂量分别为30 μg/kg、70 μg/kg和100 μg/kg。因RTX对呼吸系统具有毒性，所以在每次注射RTX前都给小鼠腹腔注射防止呼吸衰竭的保护性混合药物(0.1 mL/10 g)：0.4 mL特布他林(0.5 mg/mL)+ 0.2 mL阿托品(1 mg/mL)+ 0.4 mL氨茶碱(240 mg/5 mL)，小鼠在最后一次注射RTX后每天观察小鼠死亡情况。2周后，存活的C57BL/6小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(100 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉，存活的Kunming小鼠腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉。在相同实验室条件下：室温20～23 ℃和相对湿度40%～60%，观察小鼠病死率情况。

1．5统计学分析使用SPSS 16.0进行数据分析；2组比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

C57BL/6小鼠在皮下注射RTX后，Ⅱ组第24小时内死亡4只，第2天和第3天无小鼠死亡，总病死率为33.3%，而Ⅰ组无小鼠死亡，总病死率为0；Kunming小鼠在皮下注射RTX后，Ⅲ组和Ⅳ组均无小鼠死亡，即总病死率为0。与Ⅰ组、Ⅳ组比较，Ⅱ组病死率显著增高(P<0.05，表1)。4组小鼠在麻醉中均保持良好的麻醉状态，生命体征平稳，麻醉时间大约维持在180 min。在麻醉复苏期间，为了避免小鼠遭受同笼其他未麻醉小鼠侵袭咬死的危险，故单独饲养复苏，底部有保温的电热毯。在腹腔注射2%戊巴比妥钠(100 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉后，Ⅰ组和Ⅱ组的病死率都为0；在腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉后，Ⅲ组病死率为0，Ⅳ组的小鼠在麻醉后1～2 d内相继萎靡不振并全部死亡，病死率为100%。所以与Ⅱ组、Ⅲ组比较，Ⅳ组的病死率显著增高(P<0.01，表2)。

表1 4组皮下注射RTX后死亡数量比较

表2 不同麻醉药对RTX处理后4组病死率比较

3 讨论

RTX是一种天然存在的化学物质，发现于摩洛哥的大戟科白角麒麟，它是辣椒素的高效能类似物，活性成分估计比辣椒素高500～1 000倍。RTX是目前已知的最有效的TRPV1激动剂，可导致通道开放和钙离子内流时间过度延长，从而产生对TRPV1阳性痛觉纤维或细胞体的细胞毒作用[17-22]。RTX通过多觉型伤害性感受器引发炎症和疼痛，然后通过该途径进一步引起反应缺失，该过程称为脱敏[23-27]。它对神经源性炎症的脱敏从开始到消失多达7 d，而对疼痛的脱敏可持续3周左右[28]。同时RTX是有毒的，人体摄入10 g即可对健康造成严重损害甚至危及生命。虽然RTX在科研实验中应用广泛，但国内对其的报道少之又少。我们实验室用RTX杀死外周TRPV1阳性感觉神经纤维，在实验过程中发现，通过皮下注射RTX可导致C57BL/6小鼠死亡，却不会导致Kunming小鼠的死亡。因此，不同种属的小鼠对RTX的耐受可能不同，可根据实际情况选择小鼠的种属。

一些动物实验，特别是手术等实验，为减少动物的挣扎和保持其安静，常对动物采用必要的麻醉。麻醉质量决定着动物实验是否成功，麻醉质量的控制非常关键，对实验动物麻醉药物及剂量的正确选择，可以将麻醉对实验动物生理功能的影响降低至最低限度，从而保障实验结果的稳定性。水合氯醛和戊巴比妥钠现在已广泛应用于动物实验的麻醉，水合氯醛因只产生镇静催眠作用国外已经不允许使用，但由于其价格比较低，国内还在广泛使用。临床上，水合氯醛在小儿镇静中应用较广[29]，但也存在一定的风险[30]。根据相关文献报道以及本实验室多年麻醉经验，水合氯醛对于Kunming小鼠的麻醉较为安全，且性价比高；对于C57BL/6小鼠更倾向于戊巴比妥钠麻醉。对于RTX处理后的小鼠如何麻醉尚无文献报道，本实验表明RTX处理后的Kunming小鼠，在水合氯醛麻醉后的1～2 d内小鼠全部死亡；而戊巴比妥钠对RTX处理后的C57BL/6小鼠无影响。同时，水合氯醛对Kunming小鼠溶剂对照组无影响，说明不是麻醉剂量过大导致小鼠死亡。水合氯醛对动物胃黏膜和呼吸道影响较大，RTX对呼吸系统也有不良影响，小鼠的死亡不能排除呼吸抑制的影响。根据笔者的观察，死亡的Kunming小鼠在麻醉复苏后精神状态差，萎靡不振，所以精神损伤的可能性较大，具体机制仍待进一步研究。RTX对于不同种属的小鼠病死率有着不同的影响，水合氯醛对于RTX处理后Kunming小鼠有着明显的致死作用，此现象希望为科研工作者进行相关实验提供参考。