液相色谱-质谱联用法测定罂粟壳中5种生物碱的含量

2019-12-27黄宁唐丽君黄恩堂苏星王毅梅杨希

药品评价 2019年15期

黄宁，唐丽君，黄恩堂，苏星，王毅梅，杨希

1.鹰潭市综合检验检测中心，江西鹰潭 335000；2.江西省食品检验检测研究院，江西南昌 330001

罂粟壳为罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳，具有敛肺、涩肠、止痛的功效，用于久咳，久泻，脱肛，脘腹疼痛。收录在《中国药典》2015年版一部(以下简称药典)，但本品易成瘾[1]，需严格控制用量，所以罂粟壳的定量检测显得尤为重要。罂粟壳的活性成分主要是吗啡、罂粟碱、可待因、那可丁、蒂巴因等生物碱，目前大多研究性文献［2-20］研究罂粟壳成分主要从以上5种生物碱中选择1～5种作为分析对象，不同产地、批号的罂粟壳中生物碱的含量差异较大。药典中罂粟壳的【含量测定】项目仅对吗啡进行了控制。

笔者通过大量试验，建立了液相色谱-质谱联用法同时测定罂粟壳中吗啡、罂粟碱、可待因、那可丁、蒂巴因的含量。该方法高效快捷，分离效果好，定量准确稳定。

1 仪器与材料

1.1 仪器液相色谱/质谱联用仪(三重串联四级杆质谱)LC/MS QQQ(配四元泵、自动进样器、柱温箱、ESI电喷雾离子源，美国Agilent Technologies 1290 InfinityⅡ/6460 Triple Quad LC/MS)；电子天平(赛多利斯科学仪器上海有限公司MSE125P-1CE-DU)

1.2 材料罂粟壳药材来源于甘肃农垦医药药材有限责任公司，批号：20170304、20171210、20 171213；对照品来源见表1。

三氯甲烷、浓氨、醋酸、正丁醇、乙酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甲酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。过滤用0.22μm滤膜。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(规格为2.1×100mm，5μm)，以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)为流动相，流速0.4mL/min，柱温40℃，进样量5μL。

2.2 质谱条件ESI离子源干燥气温度300℃，干燥气流速11 L/min，毛细管电压4000V，正扫描模式，MRM多反应监测，待测化合物监测母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能等质谱参数见表2。

2.3 标准曲线的制备分别精密称取吗啡、可待因、那可汀、蒂巴因、罂粟碱对照品，用甲醇稀释至约250μg/mL的溶液，吗啡、可待因用乙腈稀释成系列浓度25、50、100、150、250ng/mL，罂粟碱、那可汀、蒂巴因用乙腈稀释成系列浓度5、10、20、30、50ng/mL，分别精密吸取标准曲线溶液各5μL，注入液-质联用仪分析，记录色谱质谱图，以响应值为纵坐标，罂粟壳生物碱浓度(ng/mL)为横坐标，分别线性回归分析。

2.4 供试品溶液的制备取样品粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置250mL具塞锥形瓶中，精密加入50mL含5%醋酸的20%甲醇溶液，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率20kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用含5%醋酸的20%甲醇溶液，补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液滤过，即得。

2.5 测定法分别精密吸取供试品溶液和标准曲线溶液各5μL，注入液相色谱-质谱联用仪，记录色谱质谱图。

表1 对照品来源

表2 各种化合物质谱条件

2.6 结果计算公式：X (%)=(ρ×V×n×100×10-9/m)%

X——试样中待测组分的含量，单位为%；

ρ——从标准曲线得到的试样中待测组分的含量，单位为ng/mL；

V——试样的体积，单位为mL；

m——试样的质量，单位为g；

n——样品稀释倍数。

2.7 线性关系考察如图5所示，按2.3制备好标准曲线，进行线性回归，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀回归方程分别为y=4.607561x+136.665908、y=27.198157x+476.925291、y=508.526038x+286.535574、y=81.784540x+181.455263、y=241.356278x+717.213296，相关系数r分别为0.99597、0.99686、0.99998、0.99905、0.99762，各生物碱在线性范围内的浓度与峰面积均呈良好线性关系，吗啡、可待因的线性范围是25～250ng/mL，罂粟碱、蒂巴因、那可汀的线性范围是5～50ng/mL。

图1 吗啡标准曲线及线性方程

图2 可待因标准曲线及线性方程

图3 罂粟碱的标准曲线和线性方程

图4 蒂巴因的标准曲线和线性方程

图5 那可汀的标准曲线和线性方程

2.8 定量限将已知低浓度的罂粟壳生物碱对照品溶液，按方法测定，以信噪比(S/N)约为10:1时相应浓度确定为定量限(LOQ)，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀的定量限分别为2.4×10-2mg/kg、2.4×10-2mg/kg、6×10-4mg/kg、6×10-4mg/kg、6×10-4mg/kg。

2.9 精密度将混合标准品连续进样6次，记录其峰面积，精密度用峰面积变化的相对标准偏差(RSD)表示，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因和那可汀的峰面积的RSD值分别为1.32%、4.63%、1.11%、0.56%、1.77%，RSD均小于5%，表明精密度良好。

2.10 稳定性试验在室温条件下，将同一份样品溶液每隔几小时(0h、2 h、4 h、8 h、12 h)测定一次，计算吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀峰面积变化的相对标准偏差(RSD)，分别为3.38%、1.38%、4.44%、4.99%、3.60%。说明样品在12h内稳定性好。

2.11 回收率试验分别精密称取相同质量的样品10份，一份不加标准品，作为测定本底值的样品。另外9份分别加入高、中、低三种浓度的标准品制备供试液，每种浓度重复3次，按方法测定，计算其样品加标回收率，吗啡的平均加标回收率是78.28%～103.62%，可待因的平均加标回收率是80.86%～108.80%，罂粟碱的平均加标回收率是84.21%～101.61%，蒂巴因的平均加标回收率是74.63%～96.40%，那可汀的平均加标回收率是76.26%～91.08%。表明本法准确度良好。

2.12 样品测定取3批罂粟壳样品(批号：20170304、20171210、20171213)，按本法测定，结果含量见表3。

表3 样品测定结果

3 试验条件的选择

3.1 提取溶剂的选择试验分别用水、甲醇、含5%醋酸的20%甲醇、70%乙醇、水饱和的正丁醇(浓氨调pH值至11)、三氯甲烷(用浓氨调pH值至9)做为溶剂提取罂粟壳生物碱，实验表明各种溶剂提取5种生物碱的效果各有优劣，综合考虑5种生物碱的提取效果以及响应值、检出限和线性范围，最后确定用含5%醋酸的20%甲醇作为提取溶剂。

3.2 流动相的选择试验尝试多种流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾+0.02mol/L磷酸氢二钠溶液、以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)为流动相、乙腈-0.01mol/L乙酸铵溶液(pH3.0、3.5、3.8、4.0、4.3)，试验表明以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)为流动相洗脱分离效果最好，如图6～10所示。

3.3 柱温的选择分别在30℃、35℃、40℃柱温下进行试验，结果在柱温40℃时峰分离度和峰型最好，如图6～10所示。