果蔬和谷物制品中多菌灵的免疫检测

柳 双 ，谢春花 ，王敏思 ，张志军 ，宋 洋

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津300387； 2 . 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；3. 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津300384）

多菌灵（Carbendazim），即 N-（2-苯并咪唑基）-氨基甲酸甲酯，是一种广谱内吸性的苯并咪唑类杀菌剂，因其具有高效、低毒、内吸的特点，在农业生产上应用广泛[1-3].近年来，由于多菌灵超范围、超剂量使用的现象普遍存在，再加上不易被降解，导致农畜产品中多菌灵残留超标问题严重[4-5].各种动物毒理实验证实，一定剂量的多菌灵可能会引起动物的肝脏、生殖器官、分泌器官、免疫系统等的异常病理现象[6-7].多菌灵的过量使用也会影响作物产量、色素含量及营养价值等[8].目前，多菌灵在中国和欧盟多个国家（地区）被允许使用，由于其具有慢性毒性，因此国际食品法典委员会和中国（GB2763—2014）规定了食品中多菌灵的限量标准.其中，食荚豌豆、番茄、黄瓜、桃、苹果、橙子的最大残留限量（MRL）分别为 0.02、3.00、0.50、2.00、3.00、0.50 mg/kg.欧盟规定多菌灵在新鲜菇类中的MRL 为0.1 mg/kg[9]，韩国和英国规定多菌灵在食用菌中的MRL 为1 mg/kg，日本规定为3 mg/kg[10].目前，食品中多菌灵的定量仍以仪器法为主，主要是利用光谱技术和色谱技术.虽然随着仪器设备的改进以及实验条件的优化，这些仪器方法的准确度和检出限逐渐降低（由mg/kg 到μg/kg），但也存在着仪器成本高、自动化程度低等问题.近年来，简单、快速的新型免疫化学分析方法逐步建立并得以广泛应用[11-12].

酶联免疫吸附测定（ELISA）通过抗原抗体特异性反应和酶催化底物显色反应的结合，将微量待测物信号转化成酶的催化信号，由于酶的催化活性明显高于化学催化剂的催化活性，因此反应信号被放大，达到了检测痕量物质的目的[13-15].如Uclés 等[16]建立了竞争ELISA 方法检测葡萄和葡萄酒中的多菌灵、 抑菌唑和噻菌灵残留，该方法的线性范围为10.0～80.0 μg/kg；Yan 等[17]基于氨基甲酸酯单克隆抗体建立ELISA 法，用以检测苹果、黄瓜、西红柿中的多菌灵含量，工作范围为0.06～7.47 ng/mL.这些研究实现了多菌灵的灵敏检测.

本研究基于多菌灵多克隆抗体，经过简单快速的前处理过程和反应条件的优化，建立了蔬菜、果汁和谷物中多菌灵残留的直接竞争ELISA 检测方法（CDELISA），并用传统的高效液相色谱法对其进行验证，最后采用该方法对香菇、小麦、黄瓜、橙子、橙汁的30个样品进行了实际样品检测.

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

仪器：全波长酶标仪（Labsystems），美国雷勃公司；96 孔酶标板，丹麦Nunc 公司；高效液相色谱仪，美国Agilent Technologies 公司；多功能食品加工机，中国帅佳电子科技有限公司.

试剂：多菌灵，加拿大TRC 公司；过氧化氢脲、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），美国 Sigma 公司；PSA 吸附剂（40～60 μm），美国 Sepax Technologies，Inc公司；牛血清白蛋白（BSA）、β-环糊精，德国Merck 公司；二甲基亚砜（DMSO），J&K 公司；酶标二抗（羊抗兔，5000），上海斯信生物技术有限公司； 硫酸（分析纯）、冰醋酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），天津市化学试剂供销公司；多菌灵多克隆抗体、多菌灵包被原（半抗原与鸡卵白蛋白的耦联化合物），本课题组合成.

pH 值为9.6 的碳酸钠缓冲液（包被缓冲液），磷酸氢二钾溶液（0.066 mol/L, pH 为 9.0），PBS（0.01 mol/L磷酸钠缓冲液，pH = 7.4），PBST（1 L PBS 加 0.5 g 吐温），PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）.

1.2 多菌灵CD-ELISA 方法的建立

不同反应条件对ELISA 中抗原抗体的特异性识别和酶与底物的显色放大反应均有不同程度的影响，甚至是阻止反应进行，考虑到参与反应的抗体和酶所具备的特性，一般影响较大的反应条件有溶液的离子浓度、pH 值以及有机试剂的含量等.本研究对这些反应条件进行了优化.

1.2.1 酶标抗原稀释倍数的优化

利用CD-ELISA 法，抗体包被量为每孔1 μg，用酶标仪进行双波长（450 nm 和650 nm）检测，选择吸光度在0.8～1.2 间的酶标抗原稀释倍数为最优[18]. 具体操作步骤如下.

①包被：抗体包被量为每孔1 μg，37 ℃下孵育3 h，PBST 冲洗 3 次；②封闭：每孔中加入 200 μL 质量分数为0.5%的脱脂奶粉，室温静置1 h，PBST 冲洗4 次；③竞争实验：空白孔加入100 μL PBS，实验组分别加入3 倍梯度稀释的酶标抗原100 μL，室温孵育1 h，PBST 冲洗 5 次；④显色：每孔加入底物液 150 μL，避光室温静置15 min 后，加入终止液终止反应；⑤测定吸光度.

1.2.2 抗体包被量的优化

设置酶标抗原稀释倍数为1.2.1 中优化的最佳稀释倍数，标准品多菌灵的质量浓度分别为0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400 μg/kg，选择 IC50值最低时的抗体包被量为最优[18].具体操作步骤如下.

①包被：抗体包被量分别为每孔 0.5、1.0、2.0 μg，37 ℃恒温孵育 3 h，PBST 冲洗 3 次；②封闭：操作方法同 1.2.1；③竞争实验：A 行的孔（空白孔）加入 100 μL PBS，B 行的孔（对照孔）加入 50 μL PBS 和 50 μL 以最佳稀释倍数稀释的酶标抗原，C～H 孔加入50 μL 酶标抗原和50 μL 多菌灵标准溶液（从低浓度到高浓度），室温孵育1 h 后，PBST 冲洗5 次；④、⑤步骤同1.2.1节.

1.2.3 缓冲液条件的优化

配制缓冲液，使其离子浓度分别为 10、20、30、40、50 mmol/L，pH 值分别为 4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5，用以稀释酶标抗原和多菌灵.反应在96 孔酶标滴定板中进行，用酶标仪读取A450和A650数值，最后根据结果中IC50值的大小和吸光度的变化选择最佳反应条件.

1.2.4 多菌灵CD-ELISA 方法的建立

利用以上优化条件，将多菌灵标准品配制成质量浓度分别为 0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400、12.800、25.600 μg/kg 的标准品溶液，进行 CD-ELISA实验.以多菌灵标准品的浓度（μg/kg）为横坐标，以抑制率（%）为纵坐标绘制标准曲线.

抑制率（IC）=[（Acontrol-Ax）/（Acontrol-A空白）]×100%式中：Acontrol为标准品浓度为零时的吸光度；Ax为标准品浓度为x 时的吸光度；A空白为空白孔的吸光度.

1.3 抗体特异性的评估

通过抗原及其结构类似物与抗体的交叉反应率（CR）来判断抗体的特异性[19-20]. 本研究选用的抗原结构类似物包括：苯菌灵（Benomyl）、托布津（Thiophanate）、速灭威（MTMC）、2-氨基苯并咪唑（2-Aminobenzimidazole）、噻苯咪唑（Thiabendazole）、甲基硫菌灵（Thiophanate-Methyl）.

CR（%）=[IC50（多菌灵）/IC50（compound）]×100式中：IC50为抑制率为50%对应的标准品浓度.

1.4 消除基质影响

样品中的一些化合物，如色素、盐、糖等都可能影响抗原抗体的结合或抑制酶的活性[19].一般情况下，简单稀释就足以消除基质影响，而且稀释倍数的增大通常都伴随着基质影响的减小，但考虑到方法的检测限（LOD）和灵敏度，稀释倍数不能太大[20].因此，在保持稀释倍数尽可能小的情况下，使用一些掩蔽剂（PSA）或表面活性剂（Tween-20）来减小基质的影响和提高方法灵敏度.为了尽可能减小基质影响，本研究对基质的稀释倍数、掩蔽剂和表面活性剂的用量进行优化.

1.5 CD-ELISA 方法评估的样品准备

分别选择水果（橙子）、果汁（橙汁）、蔬菜（黄瓜）、谷物（小麦）和食用菌（香菇）为样品评估CD-ELISA 方法的各项性能指标，样品均来自天津当地市场.在添加回收实验前，每个样品都通过高效液相色谱法检测确保其不含有多菌灵和苯菌灵.将样品的可食用部分用食品加工机切碎，储存在-20 ℃下备用.

1.6 样品前处理和高效液相色谱检测

1.6.1 CD-ELISA 检测的样品处理

（1）固体样品：称取1 g 经匀浆预冷的样品，加入0.4 g 无水硫酸钠、0.1 g 无水乙酸钠、1 mL 醋酸和乙腈混合液（体积比为 1 ∶99），震荡 2 min，离心（6 000 r/min，4 ℃）3 min.取上清液加入 0.02 g PSA 吸附剂，涡旋 30 s，离心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

（2）液体样品：取 1 mL 预冷的样品，加入 1 mL 体积分数为1%的酸化乙腈，震荡2 min，加入0.1 g 无水硫酸钠、0.025 g 无水乙酸钠、0.025 g 氯化钠和0.02 g PSA 吸附剂，涡旋 30 s，离心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

处理后的样品储存于棕色小瓶中，置于-20 ℃下备用，用缓冲液稀释即可进行CD-ELISA 检测.

1.6.2 高效液相色谱检测的样品处理

（1）固体样品：处理方法参考文献[21].称取40 g 经匀浆预冷的样品，加入16 g 无水硫酸钠、2 g 无水乙酸钠和40 mL 体积分数为1%的酸化乙腈，震荡2 min，4 ℃下静置15 min.取上清液加入0.8 g PSA 吸附剂和3.2 g无水硫酸钠，涡旋 30 s，离心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取15 mL 上清液，45 ℃下减压旋蒸至1 mL.

（2）液体样品：取40 mL 预冷的样品，加入40 mL体积分数为1%的酸化乙腈，震荡2 min，加入0.8 g PSA 吸附剂、8 g 无水硫酸钠、2 g 氯化钠和 2 g 无水乙酸钠，涡旋 30 s，离心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取 15 mL上清液，45 ℃下减压旋蒸至1 mL.

处理后的样品储存于棕色小瓶中，-20 ℃备用，经0.22 μm 滤膜过滤后用以检测.

1.6.3 高效液相色谱的检测条件

高效液相色谱仪为安捷伦1200 系列，C18 柱（250 mm×4.6mm，5μm）.反应条件：进样体积为20μL，流速为1.0 mL/min，波长为286 nm，流动相为甲醇和水的等体积混合物.最终以进样浓度为横坐标，以对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并求出线性回归方程.

1.7 添加回收实验和实际样品检测

评价准确度的方法有标样对照实验、方法对照实验和添加回收实验[22].本研究利用添加回收实验评估CD-ELISA 的准确度.分别对橙子、橙汁、黄瓜、小麦以及香菇这5 种食物的样品进行加标回收实验（经检验不含多菌灵和苯菌灵），每种样品分别添加3 个浓度（10、20、40 μg/kg），每个浓度重复 3 次.样品提取液经CDELISA 法分别检测后，计算其回收率（Recovery rate），根据回收率接近100%的程度来检验方法的准确度.

回收率（%）=（测定值-空白值）/添加量×100

对橙子、橙汁、黄瓜、小麦及香菇进行抽样调查，每种抽取6 个样品进行多菌灵残留的检测.

2 结果与分析

2.1 CD-ELISA 法的建立

本研究确定CD-ELISA 法的最优条件为：酶标抗原稀释300 倍，抗体包被量为每孔0.5 μg，磷酸缓冲液浓度为10 mmol/L，pH 值为7.4，抗原抗体竞争反应时间为30 min.多菌灵标准曲线如图1 所示.由图1 可以看出，多菌灵质量浓度与抑制率呈正比，IC15=（0.30 ±0.08）μg/L，IC50=（2.00 ± 0.57）μg/L.

图1 多菌灵标准曲线Fig.1 Carbendazim standard curve

2.2 抗体特异性的评价

利用CD-ELISA 法测定抗体与多菌灵及其结构类似物的交叉反应来评价抗体的特异性，结果如表1所示.

表1 化合物与抗体的交叉反应率和IC50 值Tab.1 IC50 and CR of compounds and antibody

由表1 可以看出，该抗体可以特异性地识别多菌灵，与苯菌灵也有较高的交叉反应率（CR=56.80%），这可能是因为苯菌灵的有效成分就是多菌灵；抗体与硫菌灵和甲基硫菌灵的CR 分别为3.90%和2.10%，可能是由于二者具有2 个长链的与苯并咪唑环相似的苯环结构，因此与抗体有一定的亲和性；与其他苯并咪唑类和氨基甲酸甲酯类化合物的CR 小于0.25%.

2.3 CD-ELISA 的校正曲线及基质曲线

多菌灵校正曲线的最优制备条件为：抗体包被量为每孔0.5 μg，封闭时间为60 min，多菌灵标品（0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、8.000、16.000、80.000 μg/L）和酶标抗原（稀释300 倍）的稀释液为含有0.5%吐温-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4），抗原抗体竞争反应时间为30 min，检测过程仅需要2 h.绘制校正曲线，线性范围为0.4～580.0μg/L，即抑制率为20%～80%所对应的多菌灵浓度，IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70±0.30）μg/L.

将香菇、小麦、橙汁、橙子和黄瓜样品提取液经PBSB 稀释20 倍后的溶液作为酶标抗原和多菌灵标品的稀释液，经CD-ELISA 检测获得的抑制率曲线即为样品的基质曲线，结果如图2 和表2 所示.

图2 多菌灵CD-ELISA 校正曲线及基质曲线的比较（以香菇、橙子为例）Fig.2 Comparison of calibration curves and matrix curves of CD-ELISA（taking mushroom and orange as examples）

表2 多菌灵CD-ELISA 法校正曲线与各样品基质曲线的比较Tab.2 Comparison between calibration curve and matrix curves of carbendazim in CD-ELISA %

5 种样品的基质曲线与校正曲线几乎重合，由此可知，样品的前处理方法完全可以达到消除基质影响的目的，且该校正曲线至少可以用于这5 种样品的多菌灵残留检测.

2.4 CD-ELISA 法各项指标的评估

2.4.1 检测限和灵敏度

在CD-ELISA 方法中，检测限是IC15，即抑制率为15%时所对应的待测物中多菌灵的浓度，灵敏度是IC50，即抑制率为50%时所对应的待测物中多菌灵的浓度.根据多菌灵CD-ELISA 的校正曲线可知，检测限为（0.30±0.15）μg/L，灵敏度为（2.70±0.30）μg/L.

2.4.2 添加回收实验

对不含多菌灵的橙汁、橙子、黄瓜、香菇和小麦样品进行加标回收实验，结果如表3 所示.

表3 多菌灵在5 种样品中的添加回收率Tab.3 Recovery rates of carbendazim in five kinds of samples by CD-ELISA

由表3 可以看出，5 种样品的提取液经CD-ELISA法分别检测后，回收率为84.3%～112.7%，变异系数（CV）小于12.3%.

2.4.3 高效液相色谱法与CD-ELISA 法的对照

根据高效液相色谱法得到多菌灵的线性回归方程y=49.627x+2.524 4，相关系数为0.999 9.以香菇和小麦为材料，分别采用HPLC 和CD-ELISA 的前处理方法对样品进行处理后，同时用2 种方法进行检测，结果如表 4 和图 3 所示.其中，CD-ELISA 法的 回收率为89.7%～112.7%，平均为99.7%，变异系数低于11.0%；HPLC 法的回收率为 79.3%～104.9%，平均为95.5%，变异系数低于4.8%.虽然CD-ELISA 法回收率的集中程度略低于HPLC 法，但更接近100%.从图3可以看出，2 种方法的检测结果呈线性关系，相关系数为0.9933，说明二者具有较高的一致性，即检测多菌灵残留的新方法CD-ELISA 具有接近国标仪器法的准确度，能被应用于食品中多菌灵残留的快速检测.

表4 CD-ELISA 法与HPLC 法的比较Tab.4 Comparison between CD-ELISA and HPLC %

图3 HPLC 与CD-ELISA 的结果相关性Fig.3 Correlation between HPLC and CD-ELISA

2.5 实际样品检测结果

对天津市场的橙子、橙汁、黄瓜、小麦及香菇进行抽样调查，每种抽取6 个样品进行多菌灵残留的检测，结果如表5 所示.由表5可以看出，小麦和香菇的多菌灵检出率较高，均达到50%，但小麦6 个样品中的多菌灵含量均较低，香菇的含量较高，多菌灵超标率达到16.67%； 橙子和黄瓜的检出率分别为16.67%和33.33%，黄瓜有2 个样品的多菌灵含量较高，但未超标.橙汁的检出率和超标率均为0.多菌灵对所有样品的整体检出率为30%，超标率为3.33%.

表5 实际样品中多菌灵的检测Tab.5 Detection of carbendazim in actual samples

3 结语

本研究基于多菌灵多克隆抗体，建立了快速、高效、灵敏的CD-ELISA 法，用以检测食品中多菌灵的残留.最终确定多菌灵CD-ELISA 校正曲线的最优制备条件为：抗体包被量为每孔0.5 μg，酶标抗原稀释300 倍，多菌灵标准品和酶标抗原（稀释300 倍）的稀释液为含有 0.5 %吐温-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4）. 样品仅需经过1 倍的酸化乙腈提取（醋酸和乙腈的体积比为1 ∶99），提取液用PBSB 缓冲液稀释20 倍即可用于CD-ELISA 检测.绘制的校正曲线：IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70 ± 0.30）μg/L，线性范围为 0.40～58.0 μg/L.整个检测时间仅需2 h，达到了快速检测的目的，满足了国家对食品中多菌灵的限量标准.因此，CD-ELISA法可以作为食品中多菌灵残留的快速检测手段.