QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中氟唑磺隆和氟吡磺隆含量

（泉州出入境检验检疫局综合技术服务中心，福建泉州362000）

氟唑磺隆（flucarbazone-sodium）是磺酰脲类内吸型除草剂，原药外观为无嗅、无色的结晶粉末。对野燕麦、雀麦、看麦娘等禾本科杂草和多种双子叶杂草的防治有明显成效，其有效成分可被杂草的根和茎叶吸收，通过抑制杂草体内乙酰乳酸合成酶的活性，破坏杂草正常的生理生化代谢而发挥除草活性。氟唑磺隆可有效防除小麦田大部分禾本科杂草，同时也可防除控制部分阔叶杂草[1-3]。氟吡磺隆（flucetosulfuron）是韩国LG生命科学公司研制生产的磺酰脲类除草剂，2007年获得农业部农药临时登记，属低毒品种，作用机理是抑制杂草乙酰乳酸合成酶的活性，主要用于水稻苗后处理防除多种一年生杂草[4]。

氟唑磺隆与氟吡磺隆均属于磺酰脲类除草剂，其典型特征是活性高，安全性好，使用方便，杀草广谱，可以控制多种一年生和多年生杂草，适用于全世界的各种稻作方式，对稻田杂草的控制做了很大的贡献。GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定农药氟唑磺隆（flucarbazone-sodium）在小麦中的最大残留限量为0.01 mg/kg，氟吡磺隆（flucetosulfuron）在糙米中的最大残留限量为0.05 mg/kg；而在其他类别产品中目前暂无限量要求。氟唑磺隆和氟吡磺隆作为稻田广泛使用的磺酰脲类除草剂，虽然在我国茶园并未登记使用，但事实上是存在稻田和茶园相毗邻的情况，也就可能发生通过灌溉水等方式发生交叉污染的情况发生，同时也存在除草剂误用的可能；而实验室在茶叶的日常农残筛查过程中监测到相关物质，所以有必要建立茶叶中相关检测方法进一步对茶叶中氟唑磺隆和氟吡磺隆的监测。

目前氟唑磺隆和氟吡磺隆的检测方法主要是液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，检测对象主要是大米、小麦和土壤，当前国内尚无茶叶中氟唑磺隆与氟吡磺隆的检测标准及方法。Jung等[5]采用液相色谱-串联质谱联用法测定大米、稻杆中氟吡磺隆及其代谢物的残留量；Chan等[6]采用高效液相色谱紫外检测法测定了糙米和土壤中氟吡磺隆残留量；Xue等[7]使用石墨化碳黑吸附剂（graphitized carbon black，GCB）进行净化建立了小麦和土壤中氟唑磺隆残留量及其降解物残留量的液相色谱-串联质谱联用检测方法；侯红敏等[8]采用高效液相色谱法建立了土壤、麦粒和植株中氟唑磺隆残留的分析方法，秦曙等[9]通过液相色谱-串联质谱法测定了小麦麦粒、麦秸及土壤中氟唑磺隆的 残 留 。 QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）-高效液相色谱-串联质谱技术因其快速、简单、廉价、高效的特点，已广泛用于动植物源性食品农产品中农兽药残留、真菌毒素等的分析检测[10-18]。本文建立了基于吸附性能好、净化效率高的石墨化碳黑粉末作为吸附剂的QuEChERS方法，联合超高效液相色谱-串联质谱联用法检测了茶叶中氟唑磺隆与氟吡磺隆残留，方法操作简单、快速、准确、便宜，能满足茶叶中氟唑磺隆与氟吡磺隆残留的检测需求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱串联四极杆质谱联用仪（AB SCI EX 3500）：美国AB 公司；漩涡混合器（EOFO-945066）：美国Talboys公司；旋涡混匀器（MS 3 basic）：德国IKA公司；离心机（RJ-TDL-60B）：无锡市瑞江分析仪器有限公司；粉碎机（FW-80）：天津市泰斯特仪器有限公司。石墨化碳黑吸附剂[graphitized carbon black（GCB）sorbent]、N-丙基乙二胺吸附剂[primary secondary amine（PSA）sorbent]、C18粉末：安捷伦公司；农药标准品氟唑磺隆与氟吡磺隆（含量＞99.0%）：上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯（色谱纯）：美国M-TEDIA公司；乙酸铵、甲酸（HPLC级）：美国ROE scientific INC；试验用水均为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 QuEChERS净化管的填装

向2 mL离心管中加入合适质量的GCB、C18、PSA和无水硫酸镁混合而成。

1.3 样品前处理方法

将茶叶样品用粉碎机粉碎，过20目筛，混匀，标明样品标记。称取1 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈漩涡振荡提取10 min，4000 r/min离心，待净化。取提取液1 mL转移至填装好的QuEChERS净化管中，将离心管盖好后2 000 r/min旋涡振荡30 s，静置后取上清液过0.22 μm有机滤膜后供超高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18反相柱（2.1mm×100 mm，粒径1.7 μm）；流动相为A为添加有0.1%甲酸（体积分数）的5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序为 0～1.5 min，10%～90%B；1.5 min～3.5 min，90%B；3.5 min～3.6 min，90%～10%B；3.6 min～4.5 min，10%B。流速为 0.30 mL/min；柱温 30℃；进样量 5 μL。

1.4.2 质谱条件

电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）；正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源温度：550℃；毛细管电压：5 500 V；气帘气：172 375 Pa；碰撞气：48 265 Pa；雾化气：379 225 Pa；辅助加热气：379 225 Pa。

1.5 标准溶液的配制

氟唑磺隆和氟吡磺隆标准储备溶液：分别准确称取适量的氟唑磺隆及氟吡磺隆标准品，用乙腈稀释配制成1 000 mg/L的单种标准储备液，用乙腈稀释氟唑磺隆和氟吡磺隆标准储备溶液，得最终浓度为2 mg/L混合标准溶液；避光4℃保存。

混合标准工作溶液：用乙腈稀释2 mg/L混合标准溶液得浓度范围为0.005 mg/L～0.2 mg/L的系列混合标准工作溶液。

基质匹配标准工作溶液：称取1 g茶叶试样，按照1.3节进行样品前处理和1.4节进行上机分析，当目标化合物的定性定量离子对信噪比均小于3时，该试样确定为空白基质；空白茶叶样品按照1.3节前处理，得到茶叶基质空白提取液，根据需要用基质空白提取液将中间混合标准溶液稀释成合适浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液现配现用。

而在政策操作层面，2006年4月，民政部联合15部委出台《关于加强孤儿救助工作的意见》。“意见明确界定了新形势下儿童福利保障的对象包括两部分，一是失去父母的未成年人，不仅包括机构内集中养育的孤儿、弃婴，同时也包括社会上的散居孤儿；二是事实上无人抚养的未成年人、流浪儿童、无人抚养的服刑人员未成年子女等困境儿童也纳入保障范围之中”，首次把福利院之外的儿童福利问题纳入政策视野。2010年，中国建立了第一个儿童福利津贴制度。《国务院办公厅关于加强孤儿保障工作的意见》（国办发[2010]54号）正式出台。

2 结果与讨论

2.1 试验过程优化

2.1.1 质谱条件的优化

分别取0.2 mg/L的氟唑磺隆与氟吡磺隆标准溶液，以5 μL/min的流速分别注入到离子源，在ESI+和ESI-离子化模式下分别进行全扫描，以选择适当的电离方式和准分子离子峰。试验结果表明，氟唑磺隆与氟吡磺隆均更适合在ESI+离子化模式检测，确定定量、定性离子对后，再对去簇电压及碰撞气能量等参数进行优化，优化后的质谱条件见表1。

表1 氟唑磺隆与氟吡磺隆的质谱参数Table 1 Optimized MS/MS condition of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron

2.1.2 液相色谱条件的优化

为改善两种物质的分离度，采用1.4.1梯度洗脱的方式进行，分别考察了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时氟唑磺隆与氟吡磺隆的响应情况；为进一步改善质谱信号响应和分离效果，分别在水相中加入5 mmol/L乙酸铵、0.1%（体积分数）甲酸、5 mmol/L乙酸铵+0.1%（体积分数）甲酸考察响应分离情况，结果表明：氟唑磺隆与氟吡磺隆在甲醇-水（5 mmol/L乙酸铵+0.1%（体积分数）甲酸）作为流动相、流速为0.3 mL/min时能获得最佳的峰型和最好的响应值。优化色谱条件下氟唑磺隆与氟吡磺隆保留时间依次为2.19 min和2.51 min，该条件下定量离子对MRM色谱图见图1。

图1 氟唑磺隆与氟吡磺隆的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron

2.1.3 提取条件的优化

该试验采用漩涡振荡的提取方法，考察了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-甲苯（体积比9∶1）和乙腈-甲苯（体积比7∶3）5种提取溶剂对茶叶中氟唑磺隆与氟吡磺隆的提取效率。称取空白乌龙茶样品1 g，添加0.5 mL 1.0 mg/L的混合标准溶液，加入上述5种溶剂9.5 mL，振荡提取10 min，离心过滤后不净化直接上机分析，使用标准工作溶液制作工作曲线进行校正，比较不同提取溶液的提取效率，结果见表2。

表2 不同溶剂对氟唑磺隆与氟吡磺隆的提取结果Table 2 Extraction results of different solvents for flucarbazonesodium and flucetosulfuron

结果表明使用乙腈和乙腈-甲苯（体积比7∶3）为提取溶剂时能获得较好的提取效率，但乙腈-甲苯（体积比7∶3）溶液得到的提取液颜色更深，为减轻后续净化步骤的难度并简化试验步骤，最终选择乙腈为提取溶剂。

提取时间方面，比较了振荡提取5、10、15 min时对提取效率的影响，结果表明10分钟后延长提取时间氟唑磺隆与氟吡磺隆的回收率未明显增加，因此试验选择振荡提取时间为10 min。以上试验对于其他茶叶（红茶、白茶、普洱茶等）均可获得一致的结果。

2.1.4 净化条件的优化

大部分茶类中含有大量的色素和有机酸等杂质，容易对色谱柱和仪器造成污染，影响色谱柱的寿命。为有效去除茶叶中色素和有机酸等杂质，试验采用QuEChERS方法对提取液进行净化，试验考察了C18、GCB和PSA的净化效果及其对回收率的影响。称取1 g空白乌龙茶样品添加0.5 mL 1.0 mg/L的混合标准溶液，按“1.3”进行提取，提取液分别用 C18/MgSO4、GCB/MgSO4和PSA/MgSO43个组合的吸附剂进行净化，结果显示，以50 mg GCB+50 mgMgSO4组合净化后，提取液颜色最浅，净化效果最好，C18和PSA对色素的吸附能力较差，净化后提取液的颜色均较深。使用标准工作溶液制作工作曲线进行校正，得到不同吸附剂对样品进行处理后的加标回收率，结果见图2。

图2 不同吸附剂组合对氟唑磺隆与氟吡磺隆加标回收率的影响Fig.2 Effect of different sorbents on recoveries of flucarbazonesodium and flucetosulfuron

如图2所示，GCB/MgSO4和C18/MgSO4的回收率相当，优于PSA/MgSO4的回收率，最终根据净化效果和各组合净化回收率情况，选择GCB/MgSO4作为净化吸附剂。试验比较了不同用量GCB对茶叶提取液的净化效果及回收率的影响，试验结果表明，随着GCB用量增加，溶液颜色逐渐变浅，氟唑磺隆的回收率略微下降，但氟吡磺隆的回收率下降幅度较大。当GCB用量为50 mg时可以获得较好的净化效果，最终选择GCB用量为50 mg。

2.2 基质效应、线性关系、仪器定量限及方法定量限

基质效应是指质谱分析中基质中的干扰物会影响目标化合物的离子化，从而对目标化合物的离子化产生增强或抑制作用。目前，对于基质效应的评价方法较多，本研究参照文献方法[19]，即提取后分别定量测定空白基质提取液和纯溶剂中相同浓度分析物的响应强度，基质效应/%=空白基质标准响应值／纯溶剂标准响应值×100。一般情况下，基质效应在80%～120%之间表明时可以忽略，当消除基质超出该范围时，需要考虑如何消除基质效应。试验结果表明，乌龙茶、红茶、绿茶和白茶的样品基质对氟唑磺隆与氟吡磺隆均存在基质抑制效应，特别是对氟吡磺隆的基质效应更强，所以需要采用基质匹配标准曲线消除样品的基质效应，基质效应相关数据见表4。

在最优试验条件下，对基质匹配混合标准溶液进行超高效液相色谱-串联质谱联用仪测定，以氟唑磺隆与氟吡磺隆的质量浓度为横坐标X，单位以mg/L表示，以对应的峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性方程及相关系数。在空白样品提取液中（乌龙茶）添加适量的标准工作溶液后，以S/N=10确定方法中氟唑磺隆与氟吡磺隆的定量下限（LOQ）。结果表明，目标化合物在0.000 5 mg/L～0.05 mg/L范围内的线性关系良好，定量下限均为0.005 mg/kg，相关数据详见表3。

2.3 回收率与精密度

选用不含目标化合物的乌龙茶、绿茶、红茶、普洱茶样品为基质，按照测定低限选择加入浓度不同的氟唑磺隆与氟吡磺隆标准混合溶液，按最优化的方法进行前处理后上机，平行测定6次，基质匹配标准曲线外标法定量，得相应的回收率和相对标准偏差，见表4。

表3 方法的回归方程、相关系数、线性范围、仪器定量限、方法定量限Table 3 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r），LOQs of instrument and method

表4 氟唑磺隆与氟吡磺隆在茶叶中的基质效应、加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Matrix effect，recoveries and relative standard deviations（RSDs）of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron in tea（n=6）

结果表明，氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.005、0.02、0.1 mg/kg加标水平下的平均回收率分别为92.8%～110.3%和85.2%～97.6%，相对标准偏差（n=6）分别为3.42%～9.27%和3.65%～10.35%。

2.4 实际样品的检测

应用本方法对100个茶叶产品（包括乌龙茶、绿茶、红茶、普洱茶）进行了检测，结果在一个乌龙茶样品中检出氟唑磺隆，检测值为0.016 mg/kg。

3 结论

首次建立茶叶中氟唑磺隆和氟吡磺隆的超高效液相色谱-串联质谱仪快速检测含量的方法。研究了不同提取溶剂、吸附剂种类及吸附剂用量对提取净化效率的影响。试验结果表明：在优化试验条件下，氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.000 5 mg/L～0.05 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.998，氟唑磺隆和氟吡磺隆的方法定量限均为0.005 mg/kg。氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.005、0.02、0.1 mg/kg加标水平下的平均回收率分别为92.8%～110.3%和85.2%～97.6%，相对标准偏差（n=6）分别为3.42%～9.27%和3.65%～10.35%；该方法操作简单、快速、灵敏、成本低，能满足茶叶中氟唑磺隆和氟吡磺隆的检测需求。