微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究概述

孙晓明，辛嘉英，，*，王艳，吴永存，王宁，陈书明

（1.哈尔滨商业大学省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

阿魏酸（ferulic acid，FA）[1]，其化学名称为 4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是普遍存在于植物细胞壁中的一种酚酸，有两种异构体：顺式和反式，顺式阿魏酸为黄色油状物，一般指的反式阿魏酸为微黄色或白色斜方晶体，相对分子量194.29，熔点为174℃。反式阿魏酸水溶性差，稳定溶于乙醇，难溶于冷水、石油醚、苯，可溶于热水、丙酮、甲醇。自然界中[2]，阿魏酸以酯键和醚键分别在木质素与木质素之间、半纤维素与半纤维素之间、木质素与半纤维素之间相连接从而在植物细胞壁间形成致密的网状骨架结构，从空间上阻碍了纤维素酶和半纤维素酶的降解作用，使得整个细胞壁变得坚硬。自然条件下的阿魏酸有水溶态、脂溶态和束缚态。水溶态阿魏酸存在于植物的细胞质中，该状态下的阿魏酸与一些小分子（单糖、二糖、多胺等）结合呈易溶态；脂溶态是指阿魏酸与一些脂溶性物质（甾醇等）结合，主要存在与植物表面的蜡质层中；束缚态指阿魏酸以酯或醚的形式与植物细胞壁物质（多糖、蛋白质和木质素）结合[3]。

阿魏酸是国际公认的天然安全抗氧化剂，也是近年来认知度极高的防癌物质。具有降血脂、防治冠心病、抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、抗突变和防癌等生理功能，被广泛应用于保健品、食品添加剂、化妆品和医药等领域[4-5]。制备阿魏酸的主要方法有：从植物中直接提取法、化学合成法和生物合成法。化学合成法和生物合成法提取成本高，能耗大，不利于节约环保，所以采用酶法发酵从植物细胞壁中提取阿魏酸的绿色清洁生产方法由于其对环境友好、专一性强、反应条件温和，已成为广泛研究的热点[6-8]。

真菌、细菌和酵母都能分泌的阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，FAE）[9]是指能将阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中阿魏酸游离出来的一种酶。属于羟基酸酯酶的一个亚纲，能打断阿魏酸在谷物细胞壁中以单体和多种二聚体的形式为主与阿拉伯木聚糖和阿拉伯糖残基相连接的酯键[10-12]，破坏细胞壁骨架结构，从而释放阿魏酸。

本文主要对近年来国内外用不同产酶微生物来发酵产阿魏酸酯酶以及酶法发酵产阿魏酸的研究进展进行了综述，为研发阿魏酸新工艺提供研究依据。

1 产阿魏酸酯酶研究进展

1.1 阿魏酸酯酶的培养条件及微生物来源

在植物细胞壁中，阿魏酸主要以酯键连接到存在于细胞壁的阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，还有一部分以阿魏酸二聚体的形式连接到阿拉伯木聚糖聚合物上，阿魏酸酯酶可以打断阿魏酸与细胞壁多糖的连接，高效降解多糖并获得低聚糖及阿魏酸[10-12]。自1987年MACKENZIE CR等[13]培养橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes）时发现了阿魏酸酯酶，此后阿魏酸酯酶被认为是半纤维素水解酶。研究表明真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前从微生物中分离得到的FAE已达40多种。但绝大多数阿魏酸酯酶从真菌中分离得到，如黑曲霉（Aaspergillus niger）被普遍应用于科学研究，随着研究深入和技术水平先进化，其它的产酶菌种逐渐被发现如泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、链霉菌（如 Streptomyces avermitilis）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸杆菌（Lactobacilli）等。目前的研究发现，不同微生物产阿魏酸酯酶的酶学特性有着较大的差异，来源于真菌阿魏酸酯酶酶活性较好。部分阿魏酸酯酶的微生物发酵来源以及培养条件详见表1。

表1 自2000年以来部分产阿魏酸酯酶（FAE）的微生物来源及培养条件Table 1 Partial production of feruloyl esterase（FAE）from microbial sources and culture conditions since 2000

1.2 产阿魏酸酯酶的影响因素及理化性质

阿魏酸酯酶的真菌微生物固态发酵培养基最主要是含淀粉基和纤维素基，如甜菜渣、玉米麸、小麦麸、豆渣和醋糟。Shin等[14]以去淀粉麦麸和麦麸为发酵底物对比，发现麦麸的发酵产酶最高，接近去淀粉麦麸的2倍，表明去除麦麸中的淀粉后进行发酵产酶量会下降。并且以淀粉为唯一碳源发酵，其结果与以木糖为唯一碳源一样，都不产阿魏酸酯酶，其原因可能与阿魏酸酯酶的诱导机制有关。麦麸中的淀粉可能仅仅有利于菌体发酵初期的生长，对阿魏酸酯酶的产生无诱导作用。阿魏酸酯键可能是诱导阿魏酸酯酶产生的主要因素，这一发现为进一步研究阿魏酸酯酶提供良好基础。李干[15]经过对培养基的优化以及培养条件的测定，发现非诱导性碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、阿魏酸）存在的培养基中基本不产生阿魏酸酯酶，当糖有消耗后，才开始有微量的酶活。这可能是由于糖分解代谢物的阻遏作用。目前纤维素也可用于产生阿魏酸酯酶[23]。由于不同微生物来源的FAE酶学特性有着较大的差异：大部分相对分子量在30 kDa～70 kDa之间有但是Neocallimastix MC-2所产阿魏酸酯酶相对分子质量为11 kDa；最适pH值为4～8之间，在pH 3～10范围内稳定；最适温度及热稳定性为30℃～65℃；等电点在3～9.9之间不等。A.pullulans所产阿魏酸酯酶相对分子质量为210 kDa，等电点为6.5，最适pH值为6.7，最适温度为60℃。邓轶韬等[24]在对黑曲霉发酵去淀粉麦麸产的阿魏酸酯酶时，以葡萄糖为诱导碳源研究时发现麸皮的半纤维结构能有效的诱导产阿魏酸酯酶，并且碳氮源可以在发酵前期促进菌体快速大量生长。对于不同氮源，有机氮源如酵母提取物、蛋白胨为氮源时酶活大于硫酸铵、硝酸铵无机氮源，不同的菌株会喜好有利于自己生长和产生次级代谢产物的氮源。以1%接种量和近中性的pH值更有利于产酶。通过优化后菌株的酶活提高了37%。

1.3 产阿魏酸酯酶的分子克隆及专利

由于大多数微生物发酵产阿魏酸酯酶的量达不到工业化大规模生产的要求，在寻找新的FAE和应用来源方面，学术界和工业界都在积极研究。自2000年以来专利申请情况见表2[9]。

表2 自2000年以来阿魏酸酯酶申请和授予专利[9]Table 2 Ferulic acid esterase applications and patents granted since 2000

续表2 自2000年以来阿魏酸酯酶申请和授予专利[9]Continue table 2 Ferulic acid esterase applications and patents granted since 2000

专利中大部分包括微生物来源的FAE，其多肽序列，编码多肽的核苷酸，核酸构体，载体和包含该核苷酸的宿主细胞以及生产和使用该多肽的方法。利用现代生物技术优化微生物基因，以达到提高阿魏酸酯酶产量的目的。目前不同微生物来源的FAE被异源克隆或以其他方式克隆后，发酵不同农业副产物产阿魏酸酯酶能力的研究较少。Record等[25]将一种新构建的含有黑曲霉FAE A编码序列的cDNA载体转入有蛋白酶基因表达缺陷的黑曲霉菌株中。以葡萄糖为碳源（60 g/L），阿魏酸酯酶活性为1.236 U/mL并且该酶易于纯化。Levasseur等[26]将来自黑曲霉BRFM13的FAE B基因插入到gpd启动子控制下的表达载体中，使其在蛋白酶基因表达缺陷的黑曲霉菌株表达。转化后的阿魏酸酯酶活性达到1.079 U/mL，比由甜菜浆诱导的相同来源的非转化黑曲霉菌株的产量高16倍。

Levasseur等[27]构建了一种由AnFaeA和里氏木霉组成的嵌合酶。转入里氏木霉Rut30和CL847菌株中分别表达，发现Rut30产阿魏酸酯酶的活力比CL847菌株中的低。Abokitse等[28]研究来自温性厌氧菌的TtFaeA转入大肠杆菌后发酵小黑麦糠释放阿魏酸。反应物先用木聚糖酶37℃处理16 h，表达后的阿魏酸酯酶55℃作用5 h。研究发现该酶热稳定性高达80℃，可释放30%的阿魏酸。Wong等[6]将来自黑曲霉的AnfaeA基因克隆并转入到酿酒酵母中，发酵柳枝稷释放阿魏酸约3.01 μg/100 mg（总释放阿魏酸2 mg/g）。细菌来源的阿魏酸酯酶能从小黑麦麸皮，干燥的麦麸以及蒸汽爆炸处理后的小麦秸秆中释放出大量的阿魏酸。Wu等[5]将来自纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）的阿魏酸酯酶ScFae1和ScFae2转入大肠杆菌细胞纯化后发酵小黑麦麸皮，将0.45 U/mL克隆表达后的酶与5.3 U/mL木聚糖酶液态发酵5%黑小麦麸皮悬浮液，37℃发酵3 h。阿魏酸的最大释放量为96%。

2 释放阿魏酸的生产工艺及影响因素

现有微生物发酵释放阿魏酸方式主要有固体发酵与液体发酵两种：固态发酵（solidstate fermentation，SSF）和液态发酵（submerged fermentation，SmF）。液态发酵比固态发酵过程要复杂，实际工厂生产设备投资较大。固态发酵[9]包括将固体悬浮在液体中的深层发酵和几乎没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业副、废产品，如麸皮、薯粉、大豆饼粉、高粱、玉米粉等。并且具有生产效率高、工艺简单、操作粗放、能耗少、废液少、产物分离较容易等优点倍受重视，有可能产生一些在液体培养中不产生的酶和其他有益代谢产物。张憬等[29]利用液态深层发酵法生产同时含有阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶的混合酶制剂，协同作用于去淀粉麦麸制备阿魏酸和低聚糖，经3次降解后阿魏酸总得率为55.46%。由于小麦麸皮细胞壁是由纤维素、半纤维素和蛋白质等多种高聚物组成，半纤维素（主要为阿拉伯木聚糖）和木质素通过阿拉伯糖和阿魏酸等桥链作用形成致密的网状结构，很难降解。由此可以推测阿魏酸酯酶、木聚糖酶和纤维素酶3种酶共同作用，同时切断木聚糖间的酯键长链和降低纤维素间的阻碍作用，阿魏酸释放率将会得到进一步的提高。

微生物固态发酵释放阿魏酸的影响因素有发酵底物基质的颗粒大小、水分活度、温度、接种浓度、pH值等。Samad K A等[30]用芽孢杆菌发酵香蕉茎秆废物并应用共培养法释放阿魏酸，研究几种影响释放阿魏酸因素的影响力。结果表明：pH值＞共培养类型＞接种量＞搅拌＞发酵时间＞温度＞料液比。pH值，搅动，共培养类型和接种量对阿魏酸生产具有显着影响。在交互性因素中，pH值和温度与发酵时间的相互作用对阿魏酸产量的影响最大。

在植物细胞壁中阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖侧链残基上，纤维素与木聚糖之间的空间阻碍会影响阿魏酸酯酶的作用能力，从而影响酶与底物的有效接触，所以单一使用阿魏酸酯酶水解释放阿魏酸的效率不理想。已有报道表明，阿魏酸酯酶可以协同纤维素酶以及木聚糖酶提高植物纤维质中阿魏酸的释放量[31]。

龚燕燕等[32]用阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解麦麸制备阿魏酸的研究中发现，木聚糖酶和阿魏酸酯酶协同作用，木聚糖酶先将细胞壁中的半纤维素降解为相对分子质量相对较小的阿魏酸寡聚多糖，改变细胞壁的物理化学性质有利于阿魏酸酯酶作用于阿魏酸寡聚多糖，能促进释放FA，当木聚糖酶添加量为300 U时，FA的释放率从19.48%上升至70.10%。Topakas等[33]的报道也证明阿魏酸酯酶是释放阿魏酸的关键酶，木聚糖的添加能促进阿魏酸酯酶进一步释放阿魏酸，两者具有良好的协同作用，能有效降解小麦麸皮，提高阿魏酸的释放率。

曾妍等[34]用阿魏酸酯酶与纤维素酶协同降解麦麸释放阿魏酸，单独使用阿魏酸酯酶30 U时阿魏酸的释放率仅为4.1%，单独使用纤维素酶并不释放阿魏酸，当两种酶协同作用时，阿魏酸的释放率明显提高，经单因素试验确定双酶协同作用的最佳条件为：阿魏酸酯酶的最适添加量为30U协同纤维素酶的最适添加量为70 U，此时阿魏酸释放率达到22.9%，是阿魏酸单独作用时的5.58倍，水解时间为10 h，水解温度为40℃，水解pH值为5.0，料液质量体积比为1∶30（g/mL），此时阿魏酸的释放率为23.6%。

Wang 等[31]从嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）中分离得到的一种新型阿魏酸酯酶，单独使用水解100 mg去淀粉麦麸并不释放阿魏酸，分别与木聚糖酶和α-L-阿拉伯糖苷酶协同作用最大可以得到12.4 nmol和3.64 nmol的阿魏酸，3种酶共同作用最大可以得到15.7 nmol的阿魏酸，证明以木聚糖酶为主，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶为辅可以协同作用阿魏酸酯酶促进阿魏酸的释放。

Wu Hongli等[35]用木聚糖酶（AnXyn11A）和阿魏酸酯酶协同降解麦麸，得到产率较高的阿魏酸和低聚木糖。AnXyn11A在pH 5.0和60℃时最大活性为240 U/mL。AnFaeA在pH 5.0和45℃时最大活性为21 U/mL的。AnXyn11A和AnFaeA协同作用于去淀粉麦麸（DSWB），释放的FA与单独酶作用下（仅释放FA的16.8%）相比增加至70%。

Wu等[5]用在大肠杆菌中表达的新型阿魏酸酯酶ScFAE2发酵黑小麦麸皮即得阿魏酸为2.22 mg/g；Benoit I等[36]用来自黑曲霉的阿魏酸酯酶发酵玉米麸皮获得阿魏酸的得率是31.22 mg/g；Xie C等[37]用来自猴头菌的阿魏酸酯酶发酵麦麸即得阿魏酸4 mg/g；Schmidt等[38]用米根霉（Rhizopus oryzae）固态发酵的方法发酵米糠，从未发酵前33 mg/g到发酵后含量为765 mg/g。

3 结束语及展望

对农林废弃物中阿魏酸的研究一直是粮油加工、生物工程等学科的研究热点之一。微生物采用固态发酵降解麦麸、米糠等废弃物释放阿魏酸比液态发酵有更好的可控条件，但是由于不同微生物来源的阿魏酸酯酶的酶特异性不同，所以对发酵条件如固态基质的选择、温度、pH值、料液比等的最优选择亟待解决。

目前，微生物直接发酵生产阿魏酸得率不佳，表明距离具体工业化生产仍有一定的差距所以在发酵过程中可采取如蒸汽爆破等辅助手段来提高阿魏酸的释放率。所以要使农林废弃物中阿魏酸在工业上得到充分生产应用，不仅要在现有研究的基础上应用现代生物技术对产阿魏酸酯酶的基因进行改良还要找到生产过程中每一个步骤的有效契合点，对工艺参数进行分析、构建、优化和创新。找到合适的发酵条件、培养条件，建立一套实用性强、节约成本的生产方法。