三种常见枸杞子中多糖提取方法研究进展

王梓轩，李娅琦，郭慧清，张泽坤，卫亚洁，马长华

（北京中医药大学中药学院，北京100102）

枸杞子是茄科植物（Solanaceae）枸杞的成熟果实，主要分布在中国西北部干旱和半干旱地区如甘肃、宁夏、青海和新疆等地[1]。枸杞子始载于《神农本草经》，具有非常重要的药用和食用价值[2]，现代药理学研究表明：枸杞具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、护肝[5]、降血糖[6]等多种药理活性[7-8]。其中，枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）与其诸多生理活性密切相关，是枸杞中的主要有效成分[9-11]，因此尽可能多地提取枸杞子中的多糖成分对枸杞的开发利用尤为重要。枸杞多糖常用提取方法有水提法[12-13]、超声法[14-16]，酶法[17-18]、微波法[19-20]等，有关综述仅对不同提取方法中影响其提取率的因素进行了总结，提取方法也局限于传统方法，而本文以枸杞子的种类为落脚点，不仅对目前研究较多的3种枸杞子即新疆枸杞（L.dasystemum Pojark.）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）和宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的多糖提取方法研究进行了总结，而且对一些新兴提取技术也进行了分析对比，以期能为提取不同枸杞子中枸杞多糖，枸杞有效合理开发利用以及枸杞资源产业链发展提供科学参考。

1 新疆枸杞子中枸杞多糖的提取方法

1.1 热水浸提法

热水浸提法操作简易，但提取效率和纯度偏低。在该法中，温度是影响枸杞多糖提取率的首要因素[21-22]。升高温度会提高多糖得率，但过高会引起多糖水解而破坏多糖结构，因此控制提取温度是关键。黄文书等[21]研究发现：采用热水提取法提取枸杞多糖时，影响提取率的各因素主次顺序为温度、时间、水料比、pH。最佳提取工艺为提取温度98℃，水料比10∶1，提取时间2 h，pH 11。并且证明了碱性条件会提高枸杞多糖的得率，其原因可能是加强了对植物细胞壁及细胞膜的破坏而增加了细胞内多糖的溶出度。但在碱性环境下，多糖糖苷键易发生断裂而使枸杞多糖的生物活性受到影响，并且提取过程生成的物质不易消除，提取后液体需要中和，后期处理繁琐，因此碱液提取的研究较少[23]。而许程剑等[22]实验结果表明影响得率的因素顺序为浸提温度＞浸提时间＞浸提次数＞料液比，最佳提取参数为料液比1∶20，浸提温度80℃，浸提次数3次，浸提时间3 h。许程剑等没有将pH作为一个影响因素进行考察，而是考虑了浸提次数对提取率的影响。此外，李丹丹等[24]通过进行单因素实验和响应面优化分析，确定了热水浸提枸杞多糖的最佳工艺条件：料液比为1∶27，提取温度81℃，提取时间为2.5 h，并通过三次验证实验得出LBP平均得率为5.03%，与模型预测值比较接近，说明优化出的实验条件较为可靠。

1.2 超声提取法

超声提取法是最常用也是最节约成本的方法之一，与热水浸提法相比，提取效率较高，提取条件较温和，提取结果较稳定，且不影响水溶性多糖的生物活性等，是理想的多糖提取方法[25-26]。超声波的空化作用、机械效应和热作用使植物细胞壁更加通透，加速了胞内多糖释放、扩散和溶解，提高了提取效率[27]。因为超声功率影响成分的溶出效率，因此该法中也要考察超声功率对枸杞多糖提取率的影响，谢晓霞等[14]探讨了温度、料液比、时间和超声功率对多糖得率的影响，结果表明影响枸杞多糖得率的因素主次顺序为浸提温度＞料液比＞浸提时间＞浸提功率，在单因素实验的基础上进行了正交试验，得出最佳工艺条件为温度75℃、料液比1∶20、时间2 h、超声功率160 W，得率可达11.03%。王航宇等[28]采用热水浸提法和超声提取法两种不同的方法对相同种类相同质量的枸杞进行提取，研究对比了枸杞多糖提取工艺和提取率。结果表明，与热水浸提法相比较，采用超声法提取时间缩短了5倍以上，提取率提高30%以上。与谢晓霞等研究不同，为了避免枸杞多糖的分解，王航宇等采用超声提取法时未将提取温度作为影响因素，提取全过程没有加热。

1.3 酶解提取法

酶解提取法是应用于中药提取的一项生物工程技术，利用酶降解植物细胞壁成分而破坏细胞壁结构，使多糖溶出度增加，从而实现提高多糖提取率的目的。所用的酶依据细胞壁结构成分来选择，例如纤维素酶，蛋白酶，果胶酶等，其中纤维素酶最为常用。与传统的热水浸提法相比，酶解提取条件温和，提取效率高，还能保持多糖原有生物活性[29]。同时，酶解法会减少化学试剂的使用，对环境和资源的保护具有一定意义。但是酶法提取成本相对较大，使该法在工业化生产中的应用有一定的局限性[30]。倪慧等[17]将提取温度，提取次数，沉淀时所用的乙醇体积及果胶酶作为影响提取率的因素，以枸杞多糖粗粉产量为指标，采用正交设计对提取工艺进行了优选，结果表明，若将产量作为首要指标而纯度作为次要指标并且考虑成本，则90℃、提取3次、每次2 h，加4倍量95%的乙醇沉淀为最佳提取工艺。此外，在对果胶酶影响的研究中发现，在枸杞试验量为20 g时，加入适量果胶酶的试验结果粗粉得量为（1.356±0.342 5）g，而未加果胶酶试验的结果粗粉得量为（1.132±0.369 8）g。可以看出加入果胶酶后枸杞多糖粗粉得量有一定的提高，但由于试验所用枸杞量较小，此因素是否具有显著性的差异还有待进一步的考察。

2 黑果枸杞子中枸杞多糖的提取方法

2.1 热水浸提法

热水浸提法虽然提取时间长，但成本低，且干扰物质少，易消除，尤其适用于游离态植物多糖的提取[31]。汪建红等[12]只研究了提取温度、提取次数和提取时间对黑果枸杞多糖提取的影响，并未将料液比作为影响因素来考察，直接将料液比确定为1∶20，通过正交试验分析，各因子对多糖提取率的作用由强到弱依次为提取温度，提取次数，提取时间，其中提取温度是影响多糖提取率的显著因子（P＜0.05），而提取次数和提取时间是非显著因子（P＞0.05）。研究确定了提取黑果枸杞多糖的最优条件为：提取温度90℃，提取时间1 h，提取3次。在最优条件下，3次提取黑果枸杞多糖平均得率为（3.67±0.31）%，黑果枸杞粗多糖含量为46.62%。鲁小静等[32]通过单因素试验只考察了水浸提温度，时间，料液比对多糖提取率的影响，利用Box-Behnken中心组合设计，采用响应面法优化枸杞多糖最佳提取工艺，最终确定提取条件为热水温度90℃，时间66min，料液比1∶25（g/mL）；在此条件下黑果枸杞多糖得率为29.36%。汪建红和鲁小静分别没有考虑料液比和提取次数对枸杞多糖提取率的影响，可能是因为这两个因素对提取率的影响并不显著[21-22]。娄涛涛等[33]对提取温度，提取时间，料液比和提取次数进行了单因素考察，对3个对枸杞多糖提取率影响显著的因素进行了响应面分析，结果表明影响因素的主次顺序为提取温度＞料液比＞提取时间，最终确定了枸杞多糖最佳提取工艺为提取时间1.95 h，温度90℃，液料比29.59∶1，为了方便应用，将其校正为提取时间2 h，温度90℃，液料比30∶1。平行3次实验，测得多糖的平均提取率为3.21%，与模型预测值基本相符。

2.2 超声提取法

陈亮等[15]采用超声法对黑果枸杞多糖进行提取，研究了提取温度，提取时间，超声功率，料液比对提取率的影响，结果表明各因素的影响大小为：料液比＞超声功率＞提取时间＞提取温度，经响应面优化，确定了提取枸杞多糖最佳工艺为液固比30 mL/g、提取温度72℃、超声功率198 W、提取时间29 min，多糖得率理论最大值为12.91%。杜丁等[34]进行了单因素试验，并用正交试验优化提取枸杞多糖的工艺，正交试验表明，4个因子对枸杞多糖提取率的影响程度顺序为：料液比＞提取时间＞超声功率＞提取温度。确定了最佳提取工艺为料液比1∶20（g/mL），超声功率150 W、浸提温度70℃、浸提时长30 min，该条件下的粗多糖得率是10.69%。与陈亮等所确定的各因素影响大小（料液比＞超声功率＞提取时间＞提取温度）存在差异，其原因可能是枸杞来源及提取用量不同而导致一系列误差；枸杞多糖与细胞组织结合力较弱，使超声功率对提取率的影响减弱，而提取时间对提取率的影响增大。不过，料液比依旧是影响枸杞提取率的首要因素，而提取温度对提取率的影响最不显著，此与热水提取法恰好相反[31]。彭强等[35]以料液比 1∶4，提取温度70℃，超声波频率40 kHz，功率50 W的条件对枸杞多糖提取了2次，第一次提取2 h，第二次提取1 h，合并两次的提取液，平行提取3次，枸杞多糖平均得率为2.11%，枸杞多糖含量为46.62%。此条件下，枸杞多糖得率虽低，但含量较高。

2.3 超声-微波协同萃取法

微波辅助提取法是利用微波来增加提取强度，提高提取效率。微波提取时间短，溶剂用量少，环保高效，可以避免长时间高温对多糖结构的破坏[36]。微波具有波动性、热特性和高频性，适用于某种成分的提取[37]。微波提取结合超声，进一步增强了提取效果。白红进等[19]以枸杞多糖提取率为指标，对常规水浴提取法、超声波提取法、微波提取法和超声-微波协同萃取法进行了比较，结果发现：超声-微波协同萃取法对枸杞多糖的提取率最高，提取率大小依次为超声-微波协同萃取法、常规水浴提取法、微波提取法和超声波提取法。

3 宁夏枸杞子中枸杞多糖的提取方法

目前，已经有多种方法被用于提取宁夏枸杞中的枸杞多糖，例如热水回流法、超声提取法、酶法、微波辅助提取法等，还包括高压脉冲电场提取法、高速剪切技术辅助提取法和超声辅助亚临界水提取法这些新方法。以提取工艺参数和提取率为指标，将目前已经用来提取宁夏枸杞子中枸杞多糖提取方法汇总，结果见表1。

表1 不同提取方法对宁夏枸杞中多糖的提取参数对比分析Table 1 Comparison of extraction parameters of polysaccharides from Lycium barbarum L.by different methods

续表1 不同提取方法对宁夏枸杞中多糖的提取参数对比分析Continue table 1 Comparison of extraction parameters of polysaccharides from Lycium barbarum L.by different methods

3.1 相同方法对宁夏枸杞中多提取对比

孙平等[38]、张崇坚等[13]、韩红等[39]、高春燕等[41]（分别为表中序号1、2、3、8）都采用了热水回流法对枸杞多糖进行了提取，以提取率为指标通过单因素和正交试验对提取工艺进行了优化，实验结果对比如下：（1）各因素对提取率影响大小不同，孙平和高春燕实验结果一致，为提取温度＞提取时间＞料液比＞提取次数，张崇坚实验结果为pH值＞提取温度＞提取时间＞提取次数＞料液比，而韩红的实验结果为提取温度＞提取次数＞提取时间＞料液比。由此可见，提取温度和提取时间为热水提取法重要考察因素。（2）提取率存在差异。存在同样情况还有师婷婷等[18]（序号5）和高春燕等[41]（序号8）使用复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1）提取枸杞多糖，关于因素影响顺序，师婷婷的实验结果为酶用量＞酶解温度＞酶解时间，而高春燕的实验结果为pH值＞时间＞提取温度＞混合酶用量，提取率也有较大的差异。此外，王月囡等[40]（序号6）和邱志敏等[20]（序号7）用微波辅助提取法提取枸杞多糖，也存在上述问题。对同种枸杞采用同样的提取方法对枸杞多糖进行提取，结果却存在较大差异，这可能与枸杞的前处理步骤和枸杞多糖含量测定方法有关，还可能受到原料质量，环境等主客观因素的干扰，需要进一步考察证实。

3.2 不同方法对宁夏枸杞中多糖提取对比

张自萍等[16]（序号4）对热水回流法和超声提取法这两种方法提取枸杞多糖进行了比较，而王月囡等[40]（序号6）与邱志敏等[20]（序号7）都分别对比了微波辅助提取法和热水回流法提取枸杞多糖，其中王月囡（序号6）的实验结果表明与热水回流法相比，微波法提取多糖提取率提高近40%。从提取条件和提取结果来看，超声提取法和微波辅助提取法都可以提高枸杞多糖的提取率使药材的利用度被提高，而且都有效缩短了提取时间使提取更高效。与微波辅助提取法不同的是，超声提取法对提取温度要求不高，可以避免高温枸杞多糖结构的破坏。师婷婷等[18]（序号5）应用酶高度专一性，选择不同的酶降解植物细胞壁不同的组成成分以提高多糖的提取率这一原理，采用不同酶辅助提取法和热水回流法提取枸杞多糖，通过单因素，正交试验或均匀设计对各个提取方法进行优化，结果表明酶辅助提取法确实使枸杞多糖的提取率显著增加，各方法提取率顺序为：混合酶（果胶酶，纤维素酶，木瓜蛋白酶各30 mg混合均匀）辅助提取法＞果胶酶辅助提取法＞纤维素酶辅助提取法＞木瓜蛋白酶辅助提取法＞木聚糖酶辅助提取法＞热水回流法。高春燕等[41]（序号8）等对热水回流法，超声辅助提取法和酶辅助提取法进行了对比，不同方法多糖提取率大小为酶辅助提取＞超声辅助提取＞热水提取；枸杞多糖溶解性和外观形态：酶法提取所得枸杞多糖最差；色素溶出量：超声提取最大。实验发现酶辅助提取枸杞多糖，加入乙醇要醇沉时，多糖沉于烧杯底部而不是浮于液面，这可能是因为酸性条件下，酶作用改变了多糖的结构。因此，研究多糖生理功能时要避免使用酶法提取多糖。超声法可能是因为超声波的剪切力作用，使原料极度粉粹而使色素溶出量增多，使多糖颜色加深，增加了后续脱色的难度。

3.3 新方法

3.3.1 高压脉冲电场提取法

高压脉冲电场（high-voltage pulsed electric field，HPEF）提取是利用细胞膜电穿孔原理使细胞壁瞬间破裂以致内容物流出，细胞膜电位被破坏，与传统破壁方法不同，是一种新兴提取方法[45]。高压脉冲电场提取法耗时短，试剂用量少，已广泛应用于食品加工和天然产物提取等方面，但在枸杞多糖提取上报道较少，也没有与其他提取方法的对比数据[42]。蔡光华等[42]（序号9）采用高压脉冲电场法对枸杞多糖进行提取，通过星点设计-响应面法对提取工艺进行优化，结果表明，在温度61.76℃，电场强度20.49 kV/cm，pH 8.98，脉冲频率 10 520 Hz，液料比 9.43 ∶1（mL/g）的条件下，枸杞多糖的提取率达到最大值为13.26%。

3.3.2 高速剪切技术辅助提取

高速剪切技术（High-speed shear dispersing emulsifier，HSDE），其原理是将样品置于高剪切分散乳化机上，使样品受到液力剪切、液层摩擦、撞击撕裂、离心挤压及湍流等各种机械力作用[46]，该技术不仅能提高提取效率，改善提取结果，降低生产成本，还具有绿色环保的特点[47-48]，已被应用于植物有效成分的提取分离中[49]。杜津昊等[43]（序号10）用高速剪切技术提取了枸杞多糖，以提取率为指标对提取工艺通过单因素和正交试验进行优化并与其他提取方法进行比较，结果表明各因素的影响依次为剪切时间＞料液比＞剪切速率＞提取时间，在提取温度60℃，剪切时间2 min，剪切速率12 000 r/min，料液比1∶12（g/mL），提取时间2 h，提取1次的条件下枸杞多糖提取率最高为27.86%。与热回流提取法、酶辅助提取法、超声辅助提取法相比，不仅大大提高了多糖的提取率，且提取温度较低，提取时间较短，多糖活性受到保护，产品纯度较高，是多糖提取的有效方法。

3.3.3 超声辅助亚临界水提取法

亚临界水是指高压热水或过热水，仍保持为液体状态，通过加压使水温达到100℃以上、临界温度374℃以下[50]。随着温度的升高，介电常数降低，相应地降低了水的极性，从而使水表现出与有机溶剂一样的性质[51]。此外，亚临界水还可以降低表面张力和固液两相间液膜强度，从而改善溶质的传质动力学，增加提取物在水中的溶解和扩散能力[52]。在亚临界水的基础上，超声辅助进一步加强了植物多糖的溶解和扩散，同时也增大了枸杞多糖的提取率。Zhao Chao等[44]（序号11）采用超声辅助亚临界水提取法提取枸杞多糖，并通过单因素和响应面法对提取参数进行优化，还与热水回流法，超声法和亚临界水提取法进行对比，结果表明，由超声辅助亚临界水提取法提取所得枸杞多糖提取率最大。

采用新方法提取枸杞多糖虽然能获得较高的提取率且提取时间较短，但在实际提取过程中并非首选提取方法，其原因可能是所用提取设备在实验室较不普及，提取条件较难把控，常用方法可以满足实验需求等。

4 总结和展望

枸杞多糖作为评价枸杞质量和功效的一大重要指标，其提取方法需要深入探讨，为以后枸杞多糖的研究提供基础。针对不同种类的枸杞，其枸杞多糖含量和活性存在差异，同一种提取方法的最佳提取工艺也不尽相同。根据对新疆枸杞，黑果枸杞和宁夏枸杞3种枸杞提取方法的分析，在目前已知的所用提取方法中，对新疆枸杞而言，酶辅助提取法对其枸杞多糖提取率最大；对黑果枸杞而言，微波-超声辅助萃取法对其枸杞多糖的提取率最大；对宁夏枸杞而言，高速剪切技术辅助提取法所得提取率最大。

经分析可以看出：不同研究人员采用同一方法对同种枸杞的多糖进行提取，所考虑的影响因素略有不同，因素的影响次序也有差别，优化所得的最佳提取工艺参数和提取率也存在差异，可能与前处理，提取仪器和操作不同有关。还需进一步对影响因素进行逐个筛查，选择出对提取率有明显影响的因素，再进行单因素和正交试验，或通过响应面设计，优化出更科学的提取工艺。

采用相同方法对不同种枸杞多糖进行提取，提取率和提取条件虽然存在差异，但会在一定范围之内，不会显著不同。从宏观上来看，提取率的大小会依赖于提取方法的不同，但也会受到枸杞种类的影响。所以，对于不同种类的枸杞，要结合自身特点找到适合自己的最佳提取方法尤为关键。

若仅仅以提取枸杞多糖为目的，从枸杞多糖含量最高的枸杞中提取即可，但要研究其他种类的枸杞多糖，则要结合枸杞的种类考虑，考察最优提取方法。

不同种类的提取方法依然处于实验室研究阶段，应从工业化生产的角度考虑，进一步优化提取工艺，为从实验室提取转变到工业生产提供科学依据，更加深层次开发研究，以便更大限度的发挥枸杞的市场价值。