顶空固相微萃取结合GC-MS分析花椒油香气成分

张玉霖，周亮，陈莉，舒婷

（湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）系芸香科花椒属植物，分为红花椒（Zanthoxylum Bungeanum Maxim）和青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb．etZucc.）两个类别，在我国的山东、四川以及陕西等地都有大面积种植[1-2]。在我国，花椒作为一种常用调味料使用已经有两千多年的历史，它可以给菜品带来麻香风味，也可以用于去除各种肉类的腥气，对个人而言则具有促进唾液分泌增加食欲的作用[3]。花椒也可以用作中药，有温中散寒、除湿止痛、杀虫解毒、治疗呕吐、风寒湿痹、齿痛等功效[4]。目前，国内外对于花椒的研究主要集中在对生花椒的提取和分析，对花椒油的研究相对较少[5]。采用新鲜花椒制成的高品质花椒油、鲜花椒油香气浓郁，但其香气大多通过嗅闻来测试。鉴于此，本研究采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，对花椒油的挥发性香味物质进行提取、分析研究，以期为建立花椒油挥发性风味成分图谱数据库、评价花椒油的品质提供数据支持[6]。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

花椒油：购买于超市；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

7890A-5975C气质联用仪：美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头、65 μm PDMS/DVB固相微萃取头、HP-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）：美国 Supelco公司；85-2恒温数显磁力搅拌器：金坛市新航仪器厂；EL204电子天平：上海Mettler Toledo公司；KHW-D-4电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 挥发性成分的测定

1.3.1 挥发性物质的萃取

在使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取花椒油挥发性香气成分前，先将萃取头进行老化。老化的条件为：250℃，载气流量为2 mL/min，老化时间为90min。无干扰峰的出现则作为老化结束的判断依据[7]。准确称量5 mL的花椒油样品于顶空瓶中，加盖密封，将其置于50℃的恒温水浴中进行搅拌吸附，吸附时间为40 min。然后将固相微萃取萃取头吸附于GC进样口，在250℃的条件下进行解吸，解吸时间为5 min。试验平行重复3次，进行数据采集与分析。

1.3.2 挥发性香气成分半定量分析

结合Nist和Wiley软件进行质谱检索，正反匹配度均大于800时予以选择。半定量分析：采用峰面积归一法进行相对含量定量。

式中：M为单组份香气成分的峰面积；N为总峰面积。

1.4 固相微萃取条件的优化

对花椒油挥发性香气成分的萃取影响较大的是总峰面积以及主峰面积，因此选用总峰面积和主峰面积作为考察指标，选择烯、醇和酯类等主要挥发性香气物质的峰面积作为分析萃取效果的判断依据。按照“1.3.1”方法，采用单因素试验，考察纤维萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB 固相微萃取头）、磁力搅拌（有、无）、电解质NaCl（有、无）、萃取时间（20、30、40、50、60 min）以及萃取温度（30、40、50、60、70、80℃）对花椒油香气成分的萃取的影响，进行优化选择。

1.5 气相色谱和质谱条件

1.5.1 色谱条件

HP-5MS石英毛细柱；载气：He，0.9 mL/min恒速流动。进样口温度250℃。进样：不分流；程序升温：初始温度设置为40℃，保持2 min，以4℃/min速度上升至160℃，再以10℃/min上升至250℃，保持5 min。

1.5.2 质谱条件

EI+，EI离子源温度200℃，电子能量70 eV，灯丝发射电流200 μA，接口温度250℃，扫描质量范围：30 amu～400 amu。

2 结果与分析

2.1 市售花椒油挥发性香气成分萃取条件的优化

2.1.1 纤维萃取头的选择

萃取头是香气成分萃取的关键，不同型号的萃取头表面涂层有差别，对挥发性物质的吸附富集能力也不同。本试验选择2种商业SPME萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 涂层），对其进行优化选择。其中，65 μm PDMS/DVB主要是用于挥发性物质、胺类、硝基芳香类化合物的分析，50/30 μm DVB/CAR/PDMS主要用于香味物质（挥发性和半挥发性C3～C20）的分析。萃取头对萃取效果的影响见图1。

图1 萃取头对萃取效果的影响Fig.1 Comparison of different SPME fibers on extraction of volatiles incommercially Zanthoxylum essential oil

由图1可以看出，在花椒油GC-MS分析结果中，PDMS/DVB萃取头的总峰面积和主峰面积均小于DVB/CAR/PDMS萃取头。这主要因为50/30 μm DVB/CAR/PDMS是双极性的，复合涂层对挥发性物质具有多重的选择性和吸附性[8]。因此，本试验选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS作为花椒油挥发性香气成分分析的萃取头。

2.1.2 搅拌对萃取效果的影响

使用磁力搅拌可使待测挥发性香气物质加速挥发，因此考察磁力搅拌对市售花椒油挥发性香气成分萃取效果的影响。磁力搅拌对萃取效果的影响见图2。

图2 磁力搅拌对萃取效果的影响Fig.2 Effect of stirring on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由图2可以看出，经过搅拌后的市售花椒油挥发性香气成分的总峰面积比未搅拌的花椒油挥发性成分的总峰面积变化要大，但是主峰面积变化相对不大。这说明，在花椒油中，某些低含量或者低挥发性的成分可以通过磁力搅拌促进挥发，进而被萃取头吸附。为尽可能保证对花椒油特征性香气成分进行完整的分析，本试验选择磁力搅拌的方式。

2.1.3 添加电解质（NaCl）对萃取效果的影响

NaCl作为一种电解质，对于一些香气物质来说可以促进其挥发度，从而提高萃取头对目标挥发性物质的萃取效率。因此考察电解质NaCl（0.2 g/mL）的加入对花椒油香气成分萃取效果的影响，结果如图3所示。

图3 无机盐（NaCl）添加对萃取效果的影响Fig.3 Effect of NaCl on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由图3可见，NaCl的加入对花椒油挥发性香气成分萃取效果的影响不显著，这可能是由于NaCl作为一种无机盐易溶于水相，而花椒油作为油相限制了NaCl对花椒油挥发性香气物质的萃取。

2.1.4 萃取温度对萃取效果的影响

温度升高一方面可以促进样品挥发性香气成分挥发，另一方面也会使得萃取头吸附的挥发性香气成分吸附量减少。因此考察不同萃取温度对花椒油挥发性香气成分萃取效果的影响，结果如图4所示。

图4 萃取温度对萃取效果的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由图4可以看出，随着萃取温度的升高，花椒油挥发性香气成分的气相色谱图的总峰面积和主峰面积均呈现先增后降的趋势。在50℃时达到最大值，因此选用50℃作为市售花椒油挥发性香气物质的最适萃取温度。

2.1.5 萃取时间对萃取效果的影响

萃取时间是指挥发性物质在萃取头吸附薄膜、顶空和样液中处于三项平衡分配所需的时间，也就是从萃取到萃取完毕所需的时间。考察萃取时间对花椒油挥发性香气成分萃取效果的影响，结果如图5所示。

图5 萃取时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of time on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由图5可以看出，萃取时间在20 min～40 min之间时，随着萃取时间的增加，萃取头不断对花椒油中挥发性香气成分进行富集，气相色谱图中的总峰面积和主峰面积均呈现上升趋势，在40 min时主峰面积和总峰面积达到最大值。因此，选取40 min作为花椒油挥发性香气成分的最佳萃取时间。

2.2 花椒油挥发性成分的GC-MS检测结果

采用优化后的市售花椒油萃取条件对市售花椒油挥发性香气成分进行萃取，得到了总离子流色谱图，如图6所示。

经过计算机与质谱库的匹配以及人工分析，确定相应化合物的名称[9]，将花椒油中的挥发性香气成分汇总，见表1。

图6 市售花椒油挥发性香气成分的GC-MS总离子流图Fig.6 Total ion current chromatogram of GC-MS of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil

表1 市售花椒油挥发性香气成分GC-MS鉴定结果Table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

续表1 市售花椒油挥发性香气成分GC-MS鉴定结果Continue table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

植物油的风味主要取决于品种、成熟度、气候条件、种植区域、加工工艺以及贮藏条件等因素，市售花椒油应该具有其固有的香气成分[10-13]。在花椒油中共检测出47种挥发性成分，占总峰面积的99.65%。含量在5%以上的单体香气成分共有4种，其中桧烯（13.05%），（E）-β-罗勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%），占总含量的57.51%。含量在1%～5%的单体香气成分共有14种，其中α-蒎烯（2.01%），α-侧柏烯（3.45%），β-蒎烯（1.08%），α-松油烯（1.18%），γ-松油烯（2.05%），异松油烯（1.21%），别罗勒烯（2.65%），反式水化香桧烯（2.77%），β-石竹烯（2.47%），小茴香醇（3.55%），乙酸橙花酯（1.08%），乙酸香叶酯（1.76%），侧柏酮（1.17%），胡椒酮（2.47%），占总含量的28.90%。其余单体香气成分的含量均在1%以下，共29种占总含量的13.59%[14-15]。

烯烃类化合物是市售花椒油香气组分中种类以及相对含量最多的一类物质，共19种，相对含量为50.85%。主要是以（E）-β-罗勒烯、桧烯、α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油烯、β-松油烯、石竹烯、异松油烯为代表的萜类及倍萜类物质。这类物质普遍较易挥发，具有强烈的木青气息、花香和药草香气。在这些烯烃类化合物中（E）-β-罗勒烯、桧烯的相对含量达到了10%以上。（E）-β-罗勒烯属于单萜化合物，在自然界作为一种引发信息素可以抑制工蜂卵巢，加速工蜂行为成熟。桧烯又称沙宾烯，也是一种单萜烯，具有消炎的作用。α-蒎烯呈现类似松木、针叶及树脂似的气息；α-石竹烯、β-石竹烯则有似丁香油的辛香和木香的气息，在香料中通常被用作辛香的修饰剂，对香味具有增效的性能；具有明显柠檬特征的果香和青香的柠檬烯以及具有辛辣的茴香气味的β-榄香烯也参与了花椒油挥发性烯烃类香气成分的组成。在市售花椒油中检测到的酯类化合物5种，均为乙酯类化合物，相对含量为21.35%。其中乙酸方樟酯的相对含量高达17.65%。乙酸芳樟酯又名乙酸沉香酯，有令人愉快的花香和果香，香气似香柠檬和薰衣草，是制备高级香精不可缺少的香料。乙酸橙花酯则有橙花和玫瑰样香气；乙酸香叶酯有清甜的香柠檬果香及甜润的玫瑰、薰衣草样香气；乙酸苯乙酯具有玫瑰、海仙花、蜂蜜样极甜的香气和甜的水果味。醇类化合物多呈现出清新的花草香气。在花椒油挥发性香气成分中共检测出9种醇类物质，相对含量为18.94%；其中以桉油精和小茴香醇的含量较高。桉油精有与樟脑相似的气味，小茴香醇则呈现木香、草香、柑橘或某些花香。醛类化合物一般会产生清香的风味，主要有油脂味、坚果味和青草味，多数醛类对油脂风味起到积极贡献作用[15-16]。在花椒油中检测到醛类共8种，相对含量为3.42%；Brunschwig等[17]研究发现植物油中C5～C9的醛类化合物多数呈现出脂肪味、水果味或者青草味等；Nieto等[18]研究表明，油脂中的油酸、亚油酸和花生四烯酸经过氧化会产生己醛，2，4-癸二烯醛也可降解得到己醛。己醛呈现生的油脂味和青草气及苹果香味，（E）-2-庚烯醛具青草香气及刺激臭，戊醛具有特殊香味等。在花椒油中共检测出酮类6种，相对含量为5.09%。在酮类物质中胡椒酮具有类似樟脑和薄荷的香气，香芹酮具有留兰香味。

3 结论

1）采用单因素试验对纤维萃取头、磁力搅拌、NaCl、萃取时间以及萃取温度进行优化得到市售花椒油挥发性香气成分最佳萃取条件。结果表明：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在磁力搅拌条件下，萃取温度为50℃，萃取时间为40 min时花椒油中的挥发性风味物质能最大程度地挥发、吸附。

2）在市售花椒油中共检测到47种挥发性香气成分，占总峰面积的91.26%。这些香气成分中主要以烯烃类为主，相对含量占50.85%，酯类、醇类次之，分别占有相对含量21.35%和18.94%，其他类挥发性香气成分的含量较低。桧烯（13.05%），（E）-β-罗勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%）是其主要的挥发性香气成分。