重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

高建欣藏雨轩杜欣军李硕

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津300457；2.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津300071）

金黄色葡萄球菌是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于自然界中，在食品加工过程中被金黄色葡萄球菌污染的食品，经食用后会引起食物中毒，这是由于金黄色葡萄球菌可分泌肠毒素和表皮剥落毒素等多种毒素[1]。在我国由金黄色葡萄球菌所引起的食物中毒占细菌性食物中毒的四分之一[2]，给食品安全带来巨大隐患。目前检测金黄色葡萄球菌方法主要有传统分离鉴定[3]和基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的检测方法[4]。分离鉴定成本低，但操作繁琐且耗时；PCR需要经历变性-退火-延伸等热循环过程，依赖于昂贵仪器设备和专业实验员，难以在基层及偏远地区广泛应用。因此迫切需要一种快速、简便、灵敏的方法检测金黄色葡萄球菌。

近年来，恒温扩增技术由于可以在某一特定温度进行核酸扩增而备受青睐，主要包括环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链置换恒温扩增（strand displacement amplification，SDA）、滚环恒温扩增（rolling circle amplification，RCA）、依赖解旋酶恒温扩增（helicase-dependent amplification，HDA）和重组酶聚合酶恒温扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）等[5]。恒温扩增技术弥补了传统方法和PCR的缺陷，实现了快速和准确检测，尤其是在缺乏完备实验室设施的情况下。RPA作为一种新型恒温快速扩增核酸的方法，与常见PCR不同，RPA可以在单一恒定温度下（37℃～42℃）快速扩增DNA，在相对短的时间内就可完成检测[6]。扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光或试纸条等检测。其中，凝胶电泳操作耗时[7]；实时荧光需借助大型仪器，价格昂贵[8]；而试纸条不仅制备简单，且不需其他设备辅助，只需5min～10 min即可得到结果[9]。试纸条有许多标记物，如胶体金、胶体碳、量子点、彩色乳胶微球等[10]。彩色聚苯乙烯乳胶微球是强疏水性的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，微球的粒径分布均一、稳定性好，在合成乳胶过程中通过加入不同颜色染料可形成多种颜色微球，且颜色稳定不易脱落，可以在一根试纸条上检测多种不同物质，每种物质分别代表不同颜色，弥补了其他标记物在多重检测产生颜色混淆的不足[11]。

金黄色葡萄球菌作为一种重要的食源性致病菌，已成为世界多数国家进出口食品法定检验检疫的致病菌之一[12]，因而建立快速有效的方法对预防金黄色葡萄球菌的感染具有重要意义。检测金黄色葡萄球菌常规方法是基于微生物方法，但耗时耗力，操作繁琐，不适合快速检测；另外常见方法是基于PCR的分子生物学方法，如PCR，real-time qPCR和巢式PCR等，然而此类方法均需要昂贵精密的实验设备，限制了其在现场检测的应用[13]。本研究将RPA和乳胶微球试纸条（latex microsphere test strips，LMTS）结合，可以快速检测金黄色葡萄球菌，同时具有高灵敏度和良好的特异性，为食品安全相关领域的快速检测提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与材料

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌：天津科技大学食品安全实验室；酵母粉和蛋白胨：青岛海博生物公司；细菌DNA提取试剂盒：北京天根生物有限公司；RPA kit：英国Twist DX公司；乳胶微球：天津大鹅科技有限公司；LB 培养基（luria-bertani，LB）：北京陆桥技术股份有限公司；1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、2-N-吗啡啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG 20000）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、磷酸缓冲盐（phosphate buffer，PB）、磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered solution，PBST）、链霉亲和素、羊抗鼠二抗：美国Sigma公司；鼠抗地高辛抗体：美国Abcam公司；试验用水均为超纯水。

1.1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水系统、Milipore HF 90 s硝酸纤维素膜：美国Millipore公司；HFU 586超低温冰箱：美国Thermo公司；5415R小型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；SY-1-2电热恒温水浴锅：天津欧诺仪器仪表有限公司；HVA-85高压灭菌器：日本Hirayama公司；DYY-7C核酸电泳仪、Gel Doc 2000凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；MS3周转式振摇器：德国IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

NCBI数据库中查询获得金黄色葡萄球菌nuc基因序列（GenBank：EF529607.1），应用 primer 5.0设计引物，同时上游引物5'端标记地高辛，下游引物5'端标记生物素，引物由苏州金唯智公司合成。

上游引物：5'digoxin-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3'；

下 游 引 物 ：5'biotin-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3'。

1.2.2 活化和免疫乳胶微球

取 400 μL 乳胶微球溶于 600 μL MES（0.1 mol/L，pH 7.4），加入 20 μL NHS（5 mg/L），充分混匀振荡，超声处理2 min，成功活化微球。向活化好的微球中加入15 μL用PB稀释的抗地高辛抗体（1 mg/mL），4℃静置孵育2 h，孵育结束后加入20%BSA和PEG 20000，4℃静置孵育30 min进行封闭。然后4℃条件下 14 000 r/min离心15 min，弃上清，用100 μL金标工作液重悬沉淀，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3 RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌

RPA 反应体系为 50 μL，其中，2.4 μL 上下游引物（10 μmol/L），29.5 μL 缓冲液，2 μLDNA 模板和 11.2 μL ddH2O，然后加入freeze-dried酶，充分振荡混匀，最后加入2.5 μL的280 nmol/L MgAc，将反应管置于40℃水浴锅反应10 min。反应结束后取10 μL产物与2 μL免疫微球混合，然后加入90 μL PBST缓冲液，混匀后滴加在试纸条的加样孔，5 min后观察结果。

1.2.4 RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度

将金黄色葡萄球菌DNA系列稀释为5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg 和 5 fg，RPA 扩增后取 100 μL产物加到试纸条样品孔中，再加入3.5 μL包被抗体的微球，充分混匀，滴加到试纸条样品垫上，5 min后观察结果。取100 μL金黄色葡萄球菌加入含有10 mL LB培养液中，37℃，200 r/min摇床培养8 h，取出后用0.9%NaCl溶液1∶10梯度稀释加入平板计数琼脂中，第2天进行平板计数。再准备金黄色葡萄球菌纯菌液依次稀释为 1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、1.2×101CFU/mL 和 1.2×100CFU/mL，使用水煮法提取基因组DNA，即取1 mL菌液置于99℃条件下裂解10 min，后迅速置于冰上冷却10 min，最后10 000 r/min离心5 min，取上清即为DNA。用RPA最佳体系进行扩增，扩增后100 μL混合物滴加在试纸条样品孔中，室温静置5 min后观察结果。

1.2.5 RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的特异性

提取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌DNA进行RPA-LMTS特异性验证。上述试验菌株DNA作为试验模板，首先进行RPA扩增，然后取10 μL扩增产物用PBST稀释至100 μL，再加入3.5 μL包被抗体的彩色乳胶微球，充分混匀，滴加到试纸条样品垫上，每个试验重复3次，5 min后观察检测结果。

1.2.6 RPA-LMTS检测实际样品

通过GB 4789.10-2016《食品安全国家标食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》鉴定样品中是否含金黄色葡萄球菌。分别称取25 g（mL）的鸡肉、猪肉和牛奶，向其中分别添加1.2×100CFU/g（mL）的金黄色葡萄球菌纯菌液。将被人工污染的金黄色葡萄球菌样品加入到含有225 mL的7.5%NaCl肉汤培养基。分别在培养0、1、2、3、4小时后采集培养物，应用水煮法提取基因组DNA，作为RPA体系的模板。应用RPA最佳体系进行扩增，扩增结束后将100 μL混合物加到试纸条样品孔中，5 min后观察结果。

2 结果与分析

2.1 灵敏度分析

灵敏度检测结果见图1。

图1 RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌灵敏度Fig.1 Sensitivity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

金黄色葡萄球菌不同浓度DNA为模板进行RPA试验，产物用微球试纸条检测，如图1a所示，检测限为500 fg DNA。为确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌纯菌液的检测限，将金黄色葡萄球菌纯菌液从1.2×106CFU/mL 10倍梯度依次稀释至1.2×100CFU/mL。如图1b所示，随着金黄色葡萄球菌的浓度增加，检测线亮度逐渐增加，当浓度为1.2×101CFU/mL时，检测线亮度与阴性对照有明显不同。因此，浓度为1.2×101CFU/mL是检测金黄色葡萄球菌纯菌液的检测限。

2.2 特异性分析

特异性检测结果见图2。

选择金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌验证RPALMTS特异性，结果显示只有金黄色葡萄球菌出现质控线和检测线，而非金黄色葡萄球菌只有一条质控线。结果说明RPA-LMTS特异性良好，不会与其他菌株发生交叉反应。

图2 RPA-LMTS对金黄色葡萄球菌特异性Fig.2 Specificity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

2.3 实际样品检测分析

为验证RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的实用性，选择牛肉、鸡肉和牛奶为待测实际样品，分别接种1.2×100CFU/mL（g）金黄色葡萄球菌，37℃增菌不同时间后收集提取DNA进行RPA-LMTS检测，结果见图3。结果显示1.2×100CFU/mL（g）金黄色葡萄球菌在牛肉、鸡肉和牛奶中增菌3小时后可被检测出。

图3 金黄色葡萄球菌增菌不同时间RPA-LMTS检测结果Fig.3 Detection of S.aureus in simulated food samples by RPALMTS after incubation for different times

3 讨论

近年来，像LAMP[14]，依赖HDA[15]和RPA等多种等温扩增技术已广泛应用于扩增核酸。LAMP是基于Bst DNA聚合酶进行链置换和DNA合成，LAMP可以在60 min内，60℃～65℃条件下进行DNA扩增[16]。然而LAMP需要4～6对的引物，且需要跨越6个不同的靶序列，引物设计较为复杂。HDA是利用DNA解旋酶打开双链DNA，并产生单链模板用于引物杂交和扩增。使用解旋酶消除了对复杂加热设备的需求，使反应能在较低的温度下进行。但在进行HDA前通常需要优化试验条件，如缓冲液组成和反应温度等，增加试验成本[5]。与以上相比，本研究通过建立了RPA-LMTS快速检测金黄色葡萄球菌，RPA可在40℃条件下扩增金黄色葡萄球菌，大大降低对试验设备的要求。

RPA是目前最快的核酸扩增技术之一，20 min内即可完成检测，RPA主要依赖于三种酶：重组酶、单链DNA结合蛋白酶和链置换DNA聚合酶。在RPA反应中，重组酶先与引物形成复合物，重组酶-引物复合物再与靶目标结合，然后在DNA聚合酶作用下进行扩增[17]。RPA还具有以下优势：第一，可以在相对较低的温度下（37℃～42℃）反应[18]；第二，如果样品中含有某些杂质也不会影响RPA，可省去DNA纯化过程，更加便捷和快速[19]；第三，RPA体系中的酶呈冻干态，运输时不需冷藏，更加便于运输。当本研究使RPA与LMTS的结合后检测更加快速，同时灵敏度提高。RPA-LMTS仅需15 min即可获得结果（包括10 min扩增和5 min检测），检测限为500 fg DNA和1.2×101CFU/mL纯菌液，且与非金黄色葡萄球菌无交叉反应，当实际样品污染量为1.2×100CFU/mL（g）金黄色葡萄球菌时，可在3.5 h内完成检测。RPA-LMTS可应用于在基层单位和现场检测金黄色葡萄球菌。