响应面法优化以SPME-GC-MS技术萃取人参花挥发性成分工艺的研究

肖阳，姜涛，韩燕燕，王中喜，王恩鹏※，陈长宝※

（1.吉林大学第一医院，长春 130021；2.长春中医药大学，长春 130117）

人参主要生长在黑龙江省、辽宁省、吉林省、河北省北部等地[1]，人参花是五加科植物人参的花蕾[2]，主要化学成分有人参皂苷、挥发性成分、脂肪酸、多糖、黄酮、多肽等[3～6]，具有镇静、抑菌、抗肿瘤及保护神经细胞等药理作用[7～11]。近年来，国内、外对人参花中皂苷类成分已经做了较多的研究，但对于人参花挥发性成分的研究相对较少。本研究利用响应面分析法对固相微萃取提取人参花挥发性成分工艺进行优化，为研究其化学成分及药理作用等提供参考依据。

1 实验材料

1.1 仪器

电子分析天平（西杰天平仪器有限公司）；高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；恒温水浴锅dsy-2-4（北京国华医疗器械厂）；SPME萃取手柄及萃取架、萃取头（PDMS，PDMS-DVB，PA）、顶空萃取瓶（美国Supelco公司）；TSQ 8000（美国 Thermo Fisher公司）。

1.2 材料

鲜人参花购于吉林省抚松县万良市场，2018年7月花期采摘。

2 实验方法

2.1 固相微萃取样品的制备

鲜人参花40℃恒温减压干燥，粉碎过20目筛备用。

2.2 气相色谱-质谱测定条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：HP-5ms（30mm 0.25mm，0.25µm）石英毛细管柱；载气、流速：氦气、1mL/min；汽化室温度：280℃；进样方式、流速：不分流进样、1mL/min；溶剂延迟时间：3.8min；程序升温见表1。

表1 程序升温表Table 1 Temperature programming table

2.2.2 质谱条件 电离源：EI源；电离能量：70eV；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；加速电压：1 300V；质量扫描范围：50amu～550amu。

2.3 人参花挥发性成分的提取及测定

称取样品，置于15mL样品瓶中，水浴加热平衡，顶空萃取，解析附1min，解析温度250℃。

2.4 萃取头的优化

称取0.6g人参花粉末，按照“2.3”项下方法操作，将样品瓶70℃水浴平衡 30min、萃取 30min，比较PDMS、PDMS-DVB、PA对人参花挥发性成分萃取量的影响。选取人参花挥发性成分中7种挥发性成分为参考对象，比较3种萃取头萃取该7种组分所得的总峰面积。

2.5 固相微萃取提取人参花挥发性成分的单因素实验

2.5.1 温度对人参花挥发性成分萃取量的影响 称取0.6g人参花粉末，按“2.3”项下方法操作，将样品瓶分别置于 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃恒温水浴锅，平衡30min，萃取30min，比较不同温度下人参花挥发性成分的总峰面积。

2.5.2 平衡时间对人参花挥发性成分萃取量的影响

称取0.6g人参花粉末，按“2.3”项下方法操作，将样品瓶置于70℃恒温水浴锅，分别平衡5min、15min、30min、45min、60min，萃取30min，比较不同平衡时间人参花挥发性成分的总峰面积。

2.5.3 萃取时间对人参花挥发性成分萃取量的影响

称取0.6g人参花粉末，按“2.3”项下方法操作，将样品瓶置于70℃恒温水浴锅，平衡30min，分别萃取5min、15min、30min、45min、60min，比较不同萃取时间人参花挥发性成分的总峰面积。

2.5.4 样品量对人参花挥发性成分萃取量的影响分别称取人参花粉末0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g，按“2.3”项下方法操作，将样品瓶置于70℃恒温水浴锅，平衡30min，萃取30min，比较不同样品量人参花挥发性成分的总峰面积。

2.6 响应面优化固相微萃取对人参花挥发性成分萃取的工艺

选取样品量（A）、温度（B）、平衡时间（C）、萃取时间（D）4个因素，设定3个水平，把总峰面积设为响应值（R），进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，并利用响应面分析法对人参花挥发性成分提取工艺进行优化。试验因素和水平见表2。

表2 响应面试验的因素和水平Tab.2 Factors and levels of response surface testing

2.7 响应模型的建立与分析

采用 Design-expert软件按照 Box-Benhnken实验设计了29组实验，24组为析因点实验，5组为重复实验，结果见表3。

表3 Box-Benhnken实验设计Tab.3 Box-Benhnken experimental design

2.8 工艺验证试验

称取0.4g人参花粉末，按“2.3”项下方法操作，样品瓶75℃水浴平衡37min，萃取43min。按照上述选取的最佳工艺条件进行3次平行实验，得出人参花挥发性成分的总峰面积。

3 实验结果

3.1 萃取头的优化

PDMS对保留时间较短的非极性或弱极性化合物的萃取能力较强，PA对极性成分表现出较强的萃取能力，PDMS-DVB对各类组分都有萃取。PDMSDVB纤维头既能分析到人参花中倍半萜烯成分，也能分析到其中的醇类等极性较大的成分，且PDMSDVB萃取头的萃取量综合起来更高些，因此选用PDMS-DVB萃取头。见图1。

图1 萃取头的优化结果Fig.1 Optimization for the extraction head

3.2 单因素实验

3.2.1 温度对人参花挥发性成分萃取量的影响50℃～70℃时，总峰面积增长明显；70℃以后总峰面积增长不明显。人参花挥发性成分的主要成分是萜类化合物，其中一些单萜类成分和低沸点的醛、醇类化合物首先挥发到样品瓶上部，由于其所占挥发物含量较低，所以，对总峰面积的影响不大。随着温度的升高，一些倍半萜类的成分逐渐挥发到气相中，增加了气相中挥发性成分的含量，峰面积此时大幅跃升。由于温度过高会增加萃取难度，所以，样品最佳平衡和萃取温度范围为60℃～80℃。见图2。

图2 温度对人参花挥发性成分萃取量的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.2 平衡时间对人参花挥发性成分萃取量的影响

平衡时间为5min～30min时，总峰面积不断增加；平衡时间达到30min时，总峰面积不再增加，样品瓶顶空空气中的挥发性成分已经趋于平衡。所以，样品的最佳平衡时间范围为15min～45min。见图3。

图3 平衡时间对人参花挥发性成分萃取量的影响Fig.3 Effect of equilibrium time on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.3 萃取时间对人参花挥发性成分萃取量的影响

萃取时间为5min～30min时，总峰面积随着时间的增加急剧上升；萃取时间达到30min后，总峰面积趋于平衡。所以，最佳萃取时间范围为15min～45min。见图4。

图4 萃取时间对人参花挥发性成分萃取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.4 样品量对人参花挥发性成分萃取量的影响样品量为0.1g～0.4g时，总峰面积急剧上升，此时样品量对人参花挥发性成分萃取量有显著影响；样品量为0.4g～0.8g时，总峰面积增长趋于平缓；样品量为0.8g～1.0g时，总峰面积呈下降趋势，可能是样品量过多，样品厚度增加，导致挥发性成分挥散到样品瓶上部，空气中的难度增加，从而导致人参花挥发性成分萃取量减少。所以，最佳样品量范围为0.4g～0.8g。见图5。

图5 样品量对人参花会挥发性成分萃取量的影响Fig.5 Effect of sample weigh on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.3 响应面试验结果与优化分析

3.3.1 响应面实验设计与结果 利用Design Expert软件对表5进行统计分析，得出总峰面积与各提取因素变量间的函数关系为总峰面积=+3.026E+010+4.503E+008 A+3.657E+009 B+1.740E+009 C+3.648E+009 D-1.458E+008 A B+7.306E+006 A C-8.894E+008 A D+6.649E+008 B C-1.058E+008 B D-3.494E+008 C D-2.329E+008 A2-3.679E+009 B2-1.920E+009C2-2.400E+009D2

为了说明回归方程的有效性及各因素对提取率的影响程度，对回归方程进行了方差分析，结果见表4。

表4 回归方程的方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

续表4

结果表明，样品量对人参花挥发性成分的总峰面积差异不显著；温度、平衡时间、萃取时间对人参花挥发性成分的总峰面积差异极显著；二次项温度、平衡时间、萃取时间对人参花挥发性成分的总峰面积差异极显著；二次项样品量对人参花挥发性成分的总峰面积差异不显著；交互项AC、AD、BC、BD对人参花挥发性成分总峰面积差异不显著。此模型的决定系数R2=0.976 9，经拟合检验得P=0.000 1＜0.01，呈极显著差异，说明该方程与实际情况拟合度很好，能够正确反映人参花挥发性成分总峰面积与样品量、温度、平衡时间、萃取时间之间的关系。经失拟检验得，P=0.486 1＞0.05，不显著，说明本试验无其他因素的显著影响，模型符合试验设计。样品量、温度、平衡时间、萃取时间的 F值分别为2.98、196.61、44.51、195.67，所以，各因素对人参花挥发性成分总峰面积的影响由大到小顺序为温度＞萃取时间＞平衡时间＞样品量。

3.3.2 响应面优化和预测 根据回归方程得出不同因子的响应面三维效应图及相应等高线图，结果可以更为直观地看出各因素交互作用对人参花挥发性成分总峰面积的影响。若三维效应图中影响因素所对应的曲线坡度越大，则表明该因素对总峰面积的影响越大，相对应表现为R值越大，从等高线图中可以看出，在圆心处为条件最大值。

温度对人参花挥发性成分总峰面积的影响比样品量大（图6），同理分析得出，各因素对总峰面积的影响为温度＞萃取时间＞平衡时间＞样品量，与表4回归方差分析结果吻合。对回归模型进行预测分析，得出固相微萃取提取人参花挥发性成分最佳工艺为样品量0.43g、温度75.43℃、平衡时间36.98min、萃取时间 43.14min（图 6～图11）。温度、萃取时间、平衡时间曲面坡度陡峭（图10、图11）。立的数学模型具有良好的预测性。利用响应面法优化得到的SPME萃取人参花挥发性成分工艺真实性好、可靠性好、重现性好，具有实用性价值。见表5。

图6 温度和样品量对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.6 Effect of temperature and sample size on total peak area of volatile components in ginseng flowers

图7 平衡时间和样品量对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.7 Effect of equilibration time and sample size on total peak area of volatile components of ginseng flowers

图8 萃取时间和样品量对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.8 Effect of extraction time and sample size on total fraction of volatile components in ginseng flowers

图9 平衡时间和温度对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.9 Effect of equilibrium time and temperature on total peak area of volatile components of ginseng flowers

图10 萃取时间和温度对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.10 Effect of extraction time and temperature on total peak area of volatile components in ginseng flowers

图11 萃取时间和平衡时间对人参花挥发性成分总峰面积的影响Fig.11 Effect of extraction time and equilibration time on total peak area of volatile components in ginseng flowers

表5 工艺验证试验结果Tab.5 Process verification test results

4 结语

结合实际，为了减小实验误差与操作难度，最佳工艺条件修正为样品量0.4g、温度75℃、平衡时间37min、萃取时间 43min。

响应面法作为一种简便、有效、易于操作的试验设计方法，近些年在优化中药提取工艺方面得到逐步应用。它不仅可以进行多因素、多水平的研究，还可以进行各因素间的交互作用研究，并进行综合性的统计与分析，最终得到最优化的工艺条件，显示出较其他设计方法更多的优势。本实验采用此法优化SPME法萃取人参花挥发性成分工艺，并建立了人参花挥发性成分总峰面积与样品量、温度、平衡时间和萃取时间关系的回归模型，经验证，该模型合理，能较好地预测人参花挥发性成分的最大总峰面积，从而得到最优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，为进一步开发利用人参花挥发性成分提供了有利的参考，为建立一种便捷、原位、快速分析的质量标准检测方法提供借鉴。