脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑细胞损伤的保护作用

柳小波, 杨 梅, 宋 佳

(1. 武汉科技大学医学院公共卫生系, 武汉 430065；2. 武汉科技大学医学院儿少卫生与妇幼保健学教研室, 武汉 430065；3. 华中科技大学同济医学院附属武汉精神卫生中心中医病区, 武汉 430022 4. 华中科技大学同济医学院附属武汉精神卫生中心精神科, 武汉 430022)

药物成瘾是作用于中枢系统的药物被反复大量使用后此类药物产生的一种依赖状态[1]。药物成瘾是一种慢性脑病, 长期服用会使其中枢神经系统发生某种病理改变, 具有一定的精神依赖性[2]。氯胺酮是一种常用的非巴比妥类麻醉药，近年来研究[3]表明，服用氯胺酮后会使血压升高、心跳加快，还可出现谵妄、幻觉等，使人成瘾。因此，建立相应的动物模型，寻找保护药物成瘾所致脑组织损伤的药物，具有重要意义。中医药可以在一定程度上缓解药物成瘾症状，但其对脑组织的保护作用及机制研究报道较少。脑心通胶囊成分包含黄芪、赤芍、丹参等，具有益气活血、化瘀通络功效，主治气滞血虚、脉络瘀阻所致中风[4]。有研究[5]显示，脑心通胶囊可以改善苯巴比妥成瘾大鼠的戒断症状，保护脑细胞组织损伤，但对氯胺酮成瘾大鼠的作用尚未见有报道。因此，本研究探索了脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑细胞损伤的保护作用，旨在分析脑心通胶囊保护脑组织损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与主要仪器、试剂

SPF级SD雄性大鼠60只, 体质量250～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2017-0022]，饲养于本动物中心屏障设施[SYXK(鄂)2017-0150]，自由摄食与饮水，12 h明暗交替，保持室温恒定为25℃。脑心通胶囊购自陕西步长制药有限公司，国药准字：Z20025001，以生理盐水制成浓度为50 mg/mL的混悬液； l-四氢巴马汀购自陕西小草科技有限公司,纯度99%； 即刻早期基因(c-fos)免疫组织化学染色试剂盒，购自中国Boster生物工程有限公司； 兔抗大鼠B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)多克隆抗体，均购自美国Santa Cruz公司； 辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔IgG，购自美国Dako公司。

1.2 观察大鼠行为学

实验前测试每只大鼠的条件位置偏爱(conditional position preference，CPP)[6]，CPP 箱由黑、灰、白3个箱体组成, 体积为 450mm×140 mm×160 mm，白箱靠右边，黑箱靠左边，灰箱在中间，将CPP箱的隔板打开让3个箱体相通，记录900 s内小鼠在每个箱内停留时间，计算CPP值(白箱停留时间减去黑箱停留时间的绝对值), 去除位置偏爱较大的大鼠(相差150 s以上)，将剩下大鼠随机分为对照组、模型组、脑心通胶囊高、中、低剂量组和阳性对照组，各10只。每组内分为白箱给药(n=5)和黑箱给药(n=5)，保证白箱给药与黑箱给药的CPP平均相差接近于零。分组后进行为期8d的CPP训练，用隔板把CPP隔为3个室，分别为白色箱、灰色箱、黑色箱。训练时按0.1mL/10g剂量腹腔给药，给完药后放入指定的箱内训练30 min，时间为早上8∶00和下午16∶00。模型组训练时在规定箱色内给予氯胺酮(10 mg/kg)，相反箱色给予生理盐水； 脑心通胶囊高中低剂量组在规定箱色内给予氯胺酮(10 mg/kg)和脑心通胶囊(500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg), 相反箱色给予生理盐水；阳性对照组在规定箱色内给予氯胺酮(10 mg/kg)和l-四氢巴马汀(20 mg/kg)，相反箱色给予生理盐水； 对照组均给予等量的生理盐水。对照组上下午都给予生理盐水，模型组、脑心通胶囊组和阳性对照组第1日上午给予相应药物，下午给予生理盐水，第2日上午给予生理盐水，下午给予相应药物，依此类推。训练结束后第2日进行CPP值测试，去掉隔板让小鼠在3个箱体自由运动，测试小鼠在每个箱内停留时间，计算CPP值。

1.3 动物造模及给药

模型组、脑心通胶囊组和阳性对照组大鼠制作氯胺酮成瘾模型[7], 模型组、脑心通胶囊组和阳性对照组经腹腔注射浓度为50 mg/mL的盐酸氯胺酮注射液(10 mg/kg), 脑心通胶囊高、中、低剂量组灌胃浓度为50 mg/mL脑心通胶囊(500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg)，阳性对照组大鼠在腹腔注射氯胺酮前30 min，腹腔注射l-四氢巴马汀(20 mg/kg)[5]； 对照组给予等量的生理盐水, 1次/d,连续7 d，给药后模型组大鼠表现出呼吸加快、活动增多等兴奋症状，且随用药次数增多，兴奋症状(站立、跳跃、转圈等)明显增多，则为造模成功[7]。造模成功后处死大鼠，迅速断头取脑，无菌取大脑皮层额叶组织。

1.4 HE染色观察脑组织病灶的病理变化

取大鼠大脑皮层额叶组织进行石蜡切片制作，采用质量分数4%多聚甲醛溶液固定，进行常规的脱水、透明、包埋和切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。

1.5 免疫组织化学检测脑组织c-fos基因的表达

取制作好的切片，采用常规方法脱蜡至水，再用质量分数1.5%H2O2-CH3OH溶液37 ℃处理30 min, 封闭，37 ℃孵育30 min，加一抗4 ℃孵育过夜。再加辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min, 显色, 镜下控制DAB显色程度, 水洗后经苏木素复染, 二甲苯透明后采用中性树胶封片。每张切片在同一条件下随机取15个视野, 采用北航医学图像管理系统进行图像分析。

1.6 Western blotting测定脑组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达

无菌取大脑皮层额叶组织及腹侧海马组织约50 mg，匀浆，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液溶解, 使用细胞裂解液提取总蛋白，采用Bradford法进行蛋白质定量。将50 μg提取的总蛋白样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳转印至硝酸纤维素膜，加质量分数5%脱脂牛奶封闭后，分别加入一抗抗体(1∶1 000)和β-actin蛋白单抗(1∶300), 4 ℃下孵育过夜，最后加二抗37 ℃下孵育2h，增强型化学发光(ECL)监测。采用Photoshop图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行分析，计量资料均以x-±s表示，对计量资料首先进行正态性检验，如果各组均满足正态性且两组间方差齐，采用单因素方差分析比较组间差异性； 若以上条件不满足则考虑非参数Mann-Whitney U检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色观察大鼠脑组织细胞的形态变化

对照组HE染色结果显示，大鼠脑组织细胞结构完整，未见细胞液化坏死等病灶(图1A)； 模型组HE染色结果显示，胞质浓缩，核固缩，细胞体积减小(图1B)； 脑心通胶囊低剂量组HE染色结果显示，胞质浓缩，核固缩，与模型组无明显差异(图1C)； 脑心通胶囊组中剂量组HE染色结果显示，脑组织细胞形态结构相对较完整，病变程度明显低于模型组(图1D)； 脑心通胶囊组高剂量组HE染色结果显示，脑组织细胞形态结构相对较完整，病变程度明显低于模型组(图1D)； 阳性对照组HE染色结果显示，脑组织细胞形态结构相对较完整，病变程度明显低于模型组，与脑心通胶囊高剂量组无明显差异(图1D)。

2.2 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠条件位置偏爱的影响

与对照组相比，模型组、脑心通胶囊高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠CPP值明显升高(P＜0.05)； 与模型组相比，脑心通胶囊高、中剂量组和阳性对照组大鼠CPP值明显降低(P＜0.05),且随着剂量升高，作用越明显(P＜0.05)(表1)。

表1 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠条件位置偏爱的影响

2.3 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑组织中c-fos表达的影响

与对照组比较，模型组、脑心通胶囊高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠脑组织c-fos表达量明显升高(P＜0.05)； 与模型组比较，脑心通胶囊高、中剂量组和阳性对照组大鼠c-fos表达量明显降低(P＜0.05), 且随着剂量升高, 作用越明显(P＜0.05)(图 2、表 2)。

2.4 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑组织凋亡蛋白的影响

与对照组比较, 模型组、脑心通胶囊高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠脑组织Caspase-3、Bax表达量明显升高(P＜0.05), Bcl-2表达量明显降低(P＜0.05)； 与模型组相比, 脑心通胶囊高、中剂量组和阳性对照组大鼠Caspase-3、Bax表达量明显下降(P＜0.05), Bcl-2表达量明显升高(P＜0.05)，且随着剂量升高，作用越明显(P＜0.05)(表3)。

3 讨论

图1 大鼠脑组织细胞的形态变化观察 (HE×400倍)

表2 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑组织c-fos基因表达的影响

氯胺酮是一种分离麻醉药物，是苯环己哌啶的衍生物，可抑制大脑联络径路和丘脑新皮层系统，长期反复服用会出现致幻作用与成瘾性[8]。l-四氢巴马汀是是中药延胡索乙的左旋物，近年来研究[9]显示，l-四氢巴马汀可以保护氯胺酮依赖大鼠的神经元损伤。因此，本研究采用氯胺酮建立了相应的动物模型，以l-四氢巴马汀为阳性对照，来分析氯胺酮成瘾对脑细胞的损伤作用。本研究中，氯胺酮成瘾大鼠的CPP明显高于正常大鼠，脑组织细胞出现明显的病理变化。CPP是一种常用的评价药物或环境对精神依赖性的经典实验模型，运用成瘾药物来改变实验动物的自主行为，以此评估药物的成瘾性，提示氯胺酮可以改变大鼠的自主行为，使大鼠成瘾[10]。临床观察表明[11]，长期使用氯胺酮的病人会出现幻觉、谵妄、恶梦等类似精神分裂症的精神症状，本研究结果与其基本一致，提示氯胺酮可以使大鼠产生成瘾现象。脑心通胶囊是一种中药制剂, 可用于治疗气虚血滞、脉络瘀阻所致中风, 临床表现为半身不遂、口眼歪斜、胸闷、脑梗塞等症候者[12]。本研究发现，中、高剂量的脑心通胶囊可明显降低氯胺酮成瘾大鼠的CPP，减轻脑组织细胞的病理变化，且随着剂量升高, 作用逐渐增强。王乔悦等[13]的研究显示，脑心通胶囊可改善神经功能, 保护脑组织损伤, 本研究结果与其基本一致, 提示脑心通胶囊可以呈浓度依赖性的显著降低氯胺酮成瘾大鼠的脑组织损伤, 改善神经症状。

表3 脑心通胶囊对氯胺酮成瘾大鼠脑组织凋亡蛋白的影响

本研究中, 中、高剂量脑心通胶囊可明显降低氯胺酮成瘾大鼠过高的c-fos基因的表达。c-fos原癌基因是即刻早期基因(IEG)的一种，正常生理情况下，c-fos基因在神经细胞中的表达水平极低，一旦受到各种外界刺激，c-fos基因出现快速大量表达，发挥其细胞核内第三信使的作用，参与调节神经细胞的生长、分化和损伤修复[14]。研究[15]显示，c-fos基因的表达与神经损伤程度密切相关，可作为神经元接受伤害性刺激激活的标志，传递伤害性刺激信息，提示脑心通胶囊可通过调节机体的信号通路，降低c-fos基因的表达，保护氯胺酮成瘾大鼠的脑组织损伤。朱华强等[16]的研究表明，药物滥用导致的成瘾是一种慢性脑损伤，可引起脑组织细胞损伤，其分子机制可能与细胞凋亡有关。细胞凋亡信号通路主要包括线粒体介导的内部细胞凋亡信号通路和死亡受体介导的外部细胞凋亡信号通路。Bcl-2/Bax蛋白可以调控线粒体膜通透性，释放凋亡激活因子来激活凋亡执行分子Caspase，活化的Caspase可以降解细胞内的多种重要蛋白，诱导细胞凋亡[17]。本研究中，中、高剂量脑心通胶囊可明显下调氯胺酮成瘾大鼠Caspase-3、Bax的表达，上调Bcl-2的表达，与王海燕等[18]的研究基本一致，提示脑心通胶囊可能通过参与调节机体的凋亡机制，保护脑组织损伤。

综上所述，脑心通胶囊可呈浓度依赖性的下调氯胺酮成瘾大鼠Caspase-3、Bax的表达，上调Bcl-2的表达，降低c-fos基因的表达，保护脑组织损伤，改善神经症状。本研究为临床上脑心通胶囊改善氯胺酮成瘾的脑组织损伤提供了一定的理论依据，但脑心通胶囊保护脑组织损伤的具体机制目前尚不清楚，有待与进一步研究。